朱樓英 方遠(yuǎn)書 余建國(浙江省金華市食品藥品檢驗所 321000 金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院)
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實驗用兔弓形蟲病血清學(xué)調(diào)查
朱樓英①方遠(yuǎn)書①余建國②(①浙江省金華市食品藥品檢驗所 321000 ②金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院)
本試驗通過免疫膠體金試紙對實驗用50只兔血樣進行檢測,調(diào)查弓形蟲病的感染情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),弓形蟲感染的陽性率為7%。
兔 弓形蟲 血清學(xué)
弓形蟲是一種專性細(xì)胞寄生性原蟲,具有廣泛的宿主群,并在世界范圍內(nèi)流行,引起人畜共患病[1]。愛滋病患者、移植用惡性腫瘤患者等免疫功能損傷或抑制者,弓形蟲作為一種機會感染因子,可致患者死亡[2]。弓形蟲病不但是醫(yī)學(xué)上的一種重要疾病,更是影響人類優(yōu)生優(yōu)育的一個重要生物因子。懷孕婦女感染弓形蟲,無論有無臨床癥狀,均可使約50%左右攜帶者因垂直傳播出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎及胎兒先天性缺陷,在養(yǎng)殖上,弓形蟲病也會造成重大損失[3]。
在臨床工作中以病原診斷作為弓形蟲病的診斷依據(jù)存在很大困難,故目前多采用免疫學(xué)診斷方法,敏感性高和特異性強的血清學(xué)檢測方法,能夠準(zhǔn)確地檢測出陽性兔和評定兔群的感染率,但常用的IHA及ELISA等方法操作煩瑣[4],只停留在實驗室階段,對基層的實驗動物中心弓形蟲病的檢測帶來諸多障礙。本研究制備的試紙條,可用于快速簡便的診斷,以彌補基層檢驗設(shè)備的缺乏和技術(shù)力量的不足。
1.1.1 試驗血清 來自某實驗動物中心的實驗用兔。隨機選取50只體重接近的實驗用兔,先對采血部位進行消毒,用1次性注射器采血2ml于離心管中,室溫靜置,待血清分離或37℃1h后,30000r/min離心5min。移取上層血清至另一離心管中,編號,作為待檢血清,4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.1.2 試驗儀器 針頭、離心機、微量加樣器、弓形蟲試紙條等由金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)研究所提供。
1.2.1 IHA(反向間接血凝)法 反應(yīng)在96孔V型微量有機玻璃板上進行,每塊反應(yīng)板設(shè)陰性血清、陽性血清、稀釋液對照孔,每孔加稀釋液25uL。在1~10排的第1孔分別加入1~10號待檢血清25uL,在第11排的第1孔加入陽性對照血清25uL,并分別倍比稀釋至第8孔。在第12排的第1孔加入陰性對照血清25uL,并分別倍比稀釋至第6孔,在第12排的第7~8孔做空白對照[5]。
凍干抗原按說明書要求稀釋,4冰箱內(nèi)靜置24h后,將稀釋抗原搖勻,每孔加25uL,然后將反應(yīng)板置于微量振蕩器上震蕩30s,于37溫箱中作用1h。在陽性對照血清滴度不低于1:1024(第5孔)、陰性對照血清除第1孔允許存在前帶現(xiàn)象(+)外,其余各孔均為(-),稀釋液對照孔為(-)的前提下,對被檢血清進行判定。被檢血清抗體滴度達(dá)到或超過1:64判為陽性。
1.2.2 試紙條法 以稀釋液將待檢血清按(1:5)稀釋。檢測時,從加樣孔滴加2~3滴待檢血清稀釋液,同時,以標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和陰性血清設(shè)陽性對照和陰性對照。2~5min內(nèi)觀察結(jié)果。10min后觀察結(jié)果無效。判定標(biāo)準(zhǔn):檢測區(qū)(T帶)、質(zhì)控區(qū)(C帶)均出現(xiàn)紅色為陽性;僅質(zhì)控區(qū)(C帶),出現(xiàn)紅色為陰性;T、C均未出現(xiàn)紅色則試紙無效。
IHA(反向間接血凝)法檢測結(jié)果及試紙條法檢測結(jié)果(見表1)。
表1 血清學(xué)檢測結(jié)果
檢測結(jié)果提示,試驗抽取的50只兔子樣品中,弓形蟲感染的陽性率約7%,且試紙條檢測的靈敏度高于IHA,表明用于快速檢測的試紙條的作用是可以確認(rèn)的。
(1)本次試驗檢出實驗用兔的弓形蟲感染率約7%,略低于周永華等報道的8.7%的結(jié)果[3],這可能與該動物中心良好的屏障系統(tǒng)與嚴(yán)格的生物安全控制措施有關(guān),但陽性兔的存在,依然給實驗用兔的疫病控制帶來諸多障礙。(2)本次檢測沒有考慮抗體的滴度分布,也沒有進行病原分離,病原檢測有利于呈現(xiàn)抗體檢測陽性而抗原檢測陰性的狀態(tài),依此判斷蟲體在體內(nèi)的發(fā)育階段及數(shù)量分布。(3)弓形蟲血清學(xué)檢測方法是多樣的,免疫層析技術(shù)是新近發(fā)展起來的體外診斷技術(shù)。具有簡單快速,操作簡便,無需特殊設(shè)備等優(yōu)點。本次試驗中應(yīng)用的弓形蟲快速檢測試紙條的性能穩(wěn)定,與傳統(tǒng)方法符合率高,這對臨床應(yīng)用而言有著重要的作用,對實驗動物屏障系統(tǒng)的完善和生物安全控制有著積極的意義,可以期待在將來發(fā)揮更加重要的作用。
[1] 崔君兆. 弓形蟲病研究九十年[J]. 實用寄生蟲病雜志, 2000, 8(2): 75-78.
[2] 陳昌源. 家養(yǎng)寵物與大群弓形蟲感染情況的研究[J]. 中國人畜共患病雜志, 2001, 17(1): 76-77.
[3] 周永華, 沈林南, 吳菁等. 實驗兔弓形蟲感染情況調(diào)查[J]. 上海實驗動物科學(xué), 1998 (1): 20.
[4] 魏梅雄, 張述義. 上海市動物弓形蟲病研究概況[J]. 中國獸醫(yī)寄生蟲病, 2001(9): 3.
[5] 張陽根. 免疫金銀染色法檢測弓形蟲抗體[J]. 上海免疫學(xué)雜志. 1996(16). 50.
項目來源:浙江省實驗動物科技項目(2009F800013)
S852.72+9
A
1007-1733(2011)08-0064-02
(2011–06–02)