李 黎,周晴晴,王艷靜,閆紅霞,石 雨,劉喜龍,康巧珍

(鄭州大學(xué)生物工程系,鄭州 450001)

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠是研究多發(fā)性硬化(MS)的經(jīng)典動(dòng)物模型,是由同種型、同種異型、異種型神經(jīng)組織抗原誘導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)白質(zhì)免疫炎性脫髓鞘性疾病模型。制備EAE動(dòng)物模型的方法多種多樣,其中利用髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)制備C57BL/6小鼠EAE模型是研究MS免疫發(fā)病機(jī)制的理想模型。C57BL/6小鼠對(duì) MOG的敏感抗原表位是 35～55位氨基酸[1]。MOG35～55抗原肽含 21個(gè)氨基酸,分子量為2582.4道爾頓。鑒于固相合成法在合成小分子多肽方面具有快速、簡(jiǎn)便、高效等優(yōu)點(diǎn),2010年 9～12月,本研究選用該方法并加以改進(jìn),用以制備MOG35～55抗原肽,并以合成的多肽免疫 C57BL/6小鼠,觀察其免疫原性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、儀器、試劑 雌性C57BL/6小鼠16只,8～10周,體質(zhì)量 16～18 g。高效液相色譜儀,凍干機(jī),多肽合成儀,質(zhì)譜儀。Fmoc-氨基酸,DIC, HOBt,DMAP,Wang樹(shù)脂,茚三酮,哌啶,吡啶,TFA, DCM,DMF,乙腈,苯酚,KCN,無(wú)水乙醇,完全弗氏佐劑(CFA),百日咳毒素(PTX)等。

1.2 方法

1.2.1 MOG35～55的合成 采用改進(jìn)的Fmoc固相法。鼠源 MOG35～55多肽含 21個(gè)氨基酸,序列為MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK。①肽鏈合成：采用Wang樹(shù)脂[3]作為固相載體,取代值為 1.51 mmol /g。取Wang樹(shù)脂0.25 g,置于多肽合成儀中,加入DMF溶脹20min,將要連接的第1個(gè)氨基酸Fmoc-Lys-OH及HOBt用少量DMF溶解,加入合成儀中,再加入DIC,混勻后置搖床振蕩10min,然后加入DMAP,置搖床反應(yīng)2.5 h;依次用DMF、MeOH、DCM、DMF洗滌(DMF2次,MeOH、DCM各3次,每次2 min);在接肽反應(yīng)之前用含20%哌啶的DMF溶液脫保護(hù)液(20 min,2次),然后加入下一個(gè)氨基酸進(jìn)行縮合。成肽反應(yīng)使用縮合劑為HoBt、DIC的混合液,反應(yīng)時(shí)間約 3 h。如此重復(fù)脫保護(hù)、縮合的過(guò)程依次由羧基端向氨基端方向延伸至肽鏈組裝完畢。在每一步縮合反應(yīng)后以茚檢試劑(5%茚三酮乙醇液、80%苯酚乙醇和含2%KCN的吡啶溶液的混合液)檢測(cè)呈陰性(溶液為亮黃色,樹(shù)脂無(wú)藍(lán)點(diǎn))即可進(jìn)行下一步脫保護(hù)。②肽樹(shù)脂的切割：切割試劑(TFA、三蒸水、苯甲硫醚、1,2-二硫醇、苯酚,其用量依次為4.95、0.3、0.3、0.15、0.3 m l)配置好放入冰箱中冷凍后加入肽樹(shù)脂,室溫下磁力攪拌 3 h左右,然后過(guò)濾到冰乙醚中,離心,收集沉淀,凍干,即得到多肽粗品。③產(chǎn)物純化：使用反相高效液相法進(jìn)行純化分析,色譜柱為C18柱;流動(dòng)相A為0.1%三氟乙酸(TFA)的超純水溶液,流動(dòng)相B為0.1% TFA的乙腈溶液;梯度洗脫(以B液濃度為基準(zhǔn))共50min,其中B液25%～70%用時(shí)40min,B液70%～70%用時(shí)5 min,B液70%～25%用時(shí)5 min;檢測(cè)波長(zhǎng)228 nm。最終用激光解析質(zhì)譜鑒定多肽,用數(shù)據(jù)分析軟件分析合成多肽的分子量。

1.2.2 EAE的誘導(dǎo) C57BL/6小鼠隨機(jī)分為EAE組和正常組,各 8只。MOG35～55多肽用 PBS稀釋后與CFA(結(jié)核桿菌的終濃度為4mg/ml)按等體積混合,用注射器反復(fù)抽吸成油包水的乳劑。EAE組每只小鼠注射0.2m l乳劑,其中MOG35～55多肽劑量為300μg/只,分別于鼠背部?jī)蓚?cè)皮下注射;在第 1次免疫后0 h和48 h腹腔注射PTX稀釋液0.1 m l, 200 ng/只。正常組注射等量生理鹽水。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)鼠體質(zhì)量檢測(cè)及神經(jīng)功能評(píng)分 實(shí)驗(yàn)鼠自免疫當(dāng)天開(kāi)始,每日稱(chēng)體質(zhì)量,并觀察小鼠的攝食情況,從初次免疫至第 31天實(shí)驗(yàn)終止前,采用盲法,每天2人至少1次在同一時(shí)間按Benson評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)EAE的嚴(yán)重性進(jìn)行臨床評(píng)估,評(píng)分≥2分者為EAE發(fā)病。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)鼠組織取材與病理學(xué)觀察 在EAE模型發(fā)病的高峰期 ,將小鼠經(jīng)水合氯醛腹腔注射麻醉后處死 ,迅速取其腦和脊髓,置 4%的多聚甲醛中固定,石蠟包埋后制成6μm厚切片,常規(guī)HE染色,鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件。組間比較用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

成功制備了 MOG35～55抗原肽,精肽產(chǎn)率為13.58%,純度為95%;其分子量為2 582.0道爾頓,與 MOG35～55的理論分子量 2 852.4道爾頓相一致。

EAE組小鼠從免疫后第 15天開(kāi)始陸續(xù)發(fā)病,至第21天8只小鼠均發(fā)病。發(fā)病后 EAE組小鼠食欲降低、體質(zhì)量減輕、皮毛不光滑、活動(dòng)量減少。同時(shí)EAE組小鼠相繼出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,表現(xiàn)為尾部無(wú)力脫垂、步履蹣跚、后肢癱瘓、行動(dòng)困難,進(jìn)而發(fā)展為四肢癱瘓,Benson評(píng)分最高為4分。正常組小鼠未出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,食欲無(wú)變化,體質(zhì)量持續(xù)增加,Benson評(píng)分為0分。

EAE組小鼠的腦和脊髓實(shí)質(zhì)中均有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),病變分布以脊髓頸腰膨大為主,表現(xiàn)為大量淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),浸潤(rùn)沿包膜和小血管由外向內(nèi)延伸,小血管周?chē)梢?jiàn)血管套形成。正常組小鼠腦和脊髓均未見(jiàn)明顯異常改變。

3 討論

MS的典型病理改變是中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性浸潤(rùn)及脫髓鞘改變。EAE的臨床表現(xiàn)和病理改變與MS極為相似,已成為研究 MS的理想動(dòng)物模型。在EAE的研究中發(fā)現(xiàn),MOG是惟一既能引起脫髓鞘抗體反應(yīng)又能引起T細(xì)胞反應(yīng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘蛋白成分[4]。雖然 MOG在髓鞘蛋白中含量很少,但由于它存在于髓鞘膜和少突膠質(zhì)細(xì)胞的最外層,故具有高度免疫原性。近年來(lái)用MOG誘導(dǎo)的EAE逐漸成為國(guó)際上研究 MS的主要模型[5]。

固相合成法在合成多肽中具有快速、簡(jiǎn)便、高效等優(yōu)點(diǎn),但需要對(duì)不參與反應(yīng)的氨基加以保護(hù),同時(shí)氨基酸側(cè)鏈上的活性基團(tuán)也要給予保護(hù)。保護(hù)基的選擇既要保證側(cè)鏈基團(tuán)不參與反應(yīng),又要保證在肽鏈合成過(guò)程中不受破壞,同時(shí)還要保證在最后肽鏈裂解時(shí)能被除去。本研究參考近年來(lái)國(guó)內(nèi)外相關(guān)方法,以 Fmoc基團(tuán)保護(hù)α-氨基[6],采用固相合成法合成MOG35～55多肽,并對(duì)固相合成法稍作改進(jìn)(在合成過(guò)程中嚴(yán)格控制反應(yīng)步驟,脫保護(hù)后盡快洗滌控制在20min左右、茚檢、加入下一個(gè)氨基酸;反應(yīng)時(shí)盡量提高反應(yīng)物濃度,加入最少量的DMF,同時(shí)控制搖床溫度和速度),合成的 MOG35～55純度可達(dá)95%,精肽產(chǎn)率達(dá)13.58%。

本研究中選用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6純系小鼠遺傳背景明確,MOG多肽的結(jié)構(gòu)明確并可精確定量,在此基礎(chǔ)上建立的EAE模型更適合從分子免疫學(xué)的角度探討 EAE的發(fā)病機(jī)制。特別值得注意的是,本研究以合成的 MOG35～55抗原肽制備 C57BL/6小鼠EAE模型均成功,對(duì)后續(xù)在某些免疫調(diào)節(jié)相關(guān)基因突變型小鼠中制備EAE模型打下了良好基礎(chǔ)。

總之,本研究采用改進(jìn)的Fmoc固相合成法,可獲得具有良好免疫原性的 MOG35～55抗原肽,用以制備的C57BL/6小鼠EAE模型穩(wěn)定可靠,為進(jìn)一步研究MS的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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