王紅梅，朱 艷，陳玉梁

(1.甘肅省農科院生物技術研究所,甘肅 蘭州 730070；2.蘭州大學生命科學學院，甘肅 蘭州 730000)

牛皮蠅蛆病是由牛皮蠅、紋皮蠅和中華皮蠅的幼蟲寄生于牛或牦牛背部皮下組織所引起的疾病的統(tǒng)稱[1]，其危害牛的健康和皮革品質，是草原放牧牛最常見和危害最嚴重的寄生蟲病之一，每年給畜牧業(yè)造成巨大的經濟損失。同時，皮蠅幼蟲還可寄生于人體，因而該病是一種人畜共患病[2-3]。

皮蠅的Hypodermin A (HA)是皮蠅幼蟲感染牛后能首先檢測到的重要抗原之一，也是牛皮蠅蛆病免疫診斷和基因工程疫苗研究的選擇性抗原[4]。純化的HA蛋白免疫牛后，可刺激機體產生抗體，有效地抵抗病原的侵襲，為寄生蟲病疫苗的研制提供了依據[5]。由于提供足夠量的天然HA具有相當大的難度，基因重組技術為免疫抗原的需求提供了平臺。有研究者采用大腸桿菌、果蠅、桿狀病毒和畢赤酵母等4種表達系統(tǒng)對HA蛋白進行了體外表達研究[6]，發(fā)現大腸桿菌表達系統(tǒng)由于不具有蛋白質二級結構折疊與修飾作用，所表達的HA蛋白不具有酶活性；HA在果蠅表達系統(tǒng)中的表達，產量可達到25 mg/L，但其無血清培養(yǎng)液過于昂貴，難以推廣應用；采用桿狀病毒表達HA蛋白，所獲產量過低，無法滿足生產的需求；畢赤酵母蛋白表達產量高，是兼有真核表達系統(tǒng)翻譯后修飾功能及原核表達系統(tǒng)方便、簡單和生產成本低等優(yōu)點的表達系統(tǒng)，為免疫抗原蛋白的生產提供了新的途徑。

紫花苜蓿(Medicagosativa)富含蛋白質、多種維生素和礦物質，是多種家畜喜食的優(yōu)質飼草，素有“牧草之王”的美稱，是一種生產植物蛋白的巨大資源寶庫[7]，在實驗室中又是牧草研究的模式植物。目前，已有多種病毒相關基因被導入苜蓿中，苜蓿表達的異源蛋白質具有良好的免疫原性，并能對機體產生較好的保護力[8-10]。本研究以紫花苜蓿優(yōu)良品種甘農1號為受體材料，采用生物技術手段將HA抗原基因導入其中，旨在為利用苜蓿作為生物反應器來生產可食性疫苗建立研究基礎。

1 材料與方法

1.1研究材料 HA抗原材料由中國農科院蘭州獸醫(yī)研究所殷宏研究員提供；紫花苜蓿甘農1號(M.sativacv.Gannong No.1)是適宜在牧區(qū)種植的抗旱、抗寒優(yōu)良品種，種子由甘肅農業(yè)大學草業(yè)學院曹致中教授提供。

1.2農桿菌和質粒 農桿菌菌株為LBA4404，質粒為pCAMBIA1300(由甘肅省農科院生物技術研究所實驗室構建并保存)。該質粒攜帶組成型啟動子CaMV 35S啟動子驅動的HA基因，以新霉素磷酸轉移合成酶nptⅡ基因作為篩選標記基因。

1.3苜蓿再生體系建立 選取飽滿的苜蓿種子，流水沖洗30 min，75%酒精消毒45 s，0.1%升汞消毒10 min，無菌水漂洗4次，吸干后接種到1/2 MS培養(yǎng)基上，25 ℃暗培養(yǎng)3 d，種子萌發(fā)后轉入光照培養(yǎng)。取5～7 d苗齡的子葉和下胚軸，子葉沿葉脈方向切成兩半，下胚軸切成0.5 cm左右的小段，接種在誘導培養(yǎng)基上，20 d后轉入分化培養(yǎng)基。每處理接種外植體30個，設3個重復。培養(yǎng)條件為(25±1) ℃，光強度為2 500 lx，光照時間16 h/d。誘導培養(yǎng)基為MS+2,4-D 1.0～2.0+6-BA 0～1.0；分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5+NAA 0.01～0.05+GA32.0；生根培養(yǎng)基為1/2 MS+IAA 0.5(激素單位：mg/L，pH值為5.8)。

1.4苜蓿轉化體系建立

1.4.1菌液濃度、浸染時間的確定 分別采用不同濃度的農桿菌菌液浸染子葉，OD600分別為0.2、0.5、0.8、1.0，20 d后觀察愈傷組織并記錄結果。用OD600為0.5的農桿菌菌液分別侵染子葉5、10和15 min，觀察愈傷組織長勢并記錄結果。

1.4.2共培養(yǎng)時間的選擇 農桿菌浸染之后，設置共培養(yǎng)時間分別為2、3、4和5 d，以研究共培養(yǎng)時間對轉化的影響，不同處理在20 d后觀察愈傷形成情況。

1.4.3抑菌素質量濃度的確定 分別采用質量濃度為0、100、200、300、400和500 mg/L的頭孢霉素(Cef) 和羧芐青霉素(Carb)的誘導培養(yǎng)基進行抗生素抑菌質量濃度的選擇，30 d后觀察統(tǒng)計生長情況。

1.4.4農桿菌浸染和植株再生 將浸染過的子葉放在無菌的濾紙上，吸去表面多余的菌液，共培養(yǎng)2 d后轉入加有50 mg/L Kan和500 mg/L Carb的培養(yǎng)基進行愈傷誘導，約3 周后轉入分化培養(yǎng)基上誘導植株再生，期間不斷調整抗菌素種類和質量濃度。

1.5轉化植株的分子檢測

1.5.1PCR檢測 DNA提取采用CTAB微量法。PCR反應體系為25 μL，其中包含10 mmol/L Tris-HCl(pH值8.3)，1.8 mmol/L MgCl2，0.2 μmol/L dNTP，0.25 μmol/L引物，1 U Taq酶，約30 ng基因組DNA。PCR反應程序：94 ℃預變性3 min，94 ℃ 50 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。擴增產物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果用凝膠成像掃描儀拍照并保存。試驗中所用生化試劑均為分析純，DNA Taq酶和電泳試劑購自上海生工，引物[9]由大連寶生物技術有限公司合成，分別在上游引物和下游引物中引入EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位點。上游引物：5′-ACGAATTCATTGTTGGTGGCTTTGAGGCCGAT-3′，下游引物：5′-GCCTCGAGTTAAAAAGATTTTGCATTTTCAGTAATC-3′，劃線部分為內切酶識別位點。

1.5.2Southern分子雜交檢測 苜蓿總DNA提取、濃度純度測定、酶切、電泳、轉移印跡、固定等，參照王關林和方宏筠[11]提供的方法。探針制備、免疫檢測參見DIG DNA Labeling and Detection Kit使用說明。預雜交、雜交方法參見ULTR-AhybTM使用說明。

2 結果與分析

2.1外源激素對苜蓿外植體愈傷組織誘導和再生的影響 建立受體材料高效再生體系對于實現遺傳轉化至關重要。針對甘農1號苜蓿特定基因型篩選誘導再生的激素種類和濃度是實現遺傳轉化的前提和保障。

2.1.1激素對紫花苜蓿愈傷組織誘導的影響 采用MS基本培養(yǎng)基附加2,4-D和6-BA兩種不同質量濃度的激素及其組合來誘導苜蓿子葉和下胚軸愈傷組織。培養(yǎng)期間發(fā)現2,4-D的存在及其質量濃度直接決定了愈傷的發(fā)生和生長狀態(tài)，培養(yǎng)基中單純使用2,4-D誘導愈傷形成的作用較為明顯，子葉和下胚軸誘導率均為100%，且愈傷的增殖非?？?，但組織結構過于疏松，表面呈白色粉末狀，完全沒有分化的可能；生長素2,4-D與細胞分裂素6-BA的組合使用誘導效果較好(圖1A)，愈傷呈淺黃綠色顆粒狀，培養(yǎng)基MS+2,4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L胚性愈傷組織誘導率高，子葉可達82%，有利于分化成苗。

2.1.2激素對苜蓿愈傷組織分化的影響 MS培養(yǎng)基附加不同種類和質量濃度的外源激素，誘導外植體出芽時間和芽分化率存在顯著差異，子葉明顯優(yōu)于下胚軸。多次試驗中發(fā)現，在附加6-BA 0.5 mg/L和NAA 0.03 mg/L的培養(yǎng)基中，子葉愈傷組織15 d轉接一次，約40 d左右分化出芽(圖1B、1C)；在培養(yǎng)基中加入2 mg/L GA3能有效提高分化率，可達48.3%，GA3具有促進幼芽發(fā)育成植株的作用。下胚軸愈傷組織需要在分化培養(yǎng)基上轉接4～5次，才有少量愈傷分化出芽，分化率約3.7%，顯著低于子葉，嚴重制約著遺傳轉化效率?？梢姡x擇恰當的外植體類型對提高分化率非常關鍵。

圖1 甘農1號苜蓿子葉愈傷組織誘導及植株再生

2.2苜蓿遺傳轉化體系優(yōu)化

2.2.1菌液濃度及感染時間對轉化的影響 通常情況下當細菌培養(yǎng)到對數生長期即OD600為0.5～0.6被認為活力最好，感染力強，收集此時的菌體，用1/2 MS液體培養(yǎng)基稀釋，使其濃度(OD600)為0.2～1.0進行試驗。結果發(fā)現，隨著菌液濃度的增大，苜蓿子葉愈傷誘導率逐步降低，但抗性愈傷組織誘導率在OD600為0.5時最高，大于0.5時逐漸降低。原因是隨著菌液濃度的不斷升高，細菌對外植體傷害越大，導致愈傷組織誘導率下降。用OD600為0.5的菌液分別浸染子葉5、10和15 min，觀察愈傷長勢情況時發(fā)現，子葉浸染小于10 min時愈傷長勢良好(圖2A、2B)，且抗性愈傷組織誘導率較高，10 min以上農桿菌則會因過度生長而無法抑制。因此，本研究中確定菌液適宜的浸染濃度(OD600)為0.5，浸染時間為8～10 min。

圖2 甘農1號苜?？剐杂鷤M織誘導及植株再生

2.2.2共培養(yǎng)時間對轉化的影響 外植體與農桿菌的共培養(yǎng)是T-DNA轉移到植物細胞的過程。農桿菌浸染外植體后不能立即實現外源基因向受體細胞的轉移和整合，一般認為需經過一定時間的“細胞調節(jié)期”才能發(fā)生這一過程[11]。因此，共培養(yǎng)時間的確定對遺傳轉化效率有著重要的影響。本研究結果表明，苜蓿子葉共培養(yǎng)時間為3 d時，抗性愈傷組織誘導率最高達58.4%(圖3)，但子葉切口邊緣都有菌絲長出，使后期培養(yǎng)過程中抑菌困難，導致轉化率降低。由此，確定2 d為比較適宜的共培養(yǎng)時間。

2.2.3選擇培養(yǎng)基中抑菌抗生素質量濃度的選擇 當頭孢霉素(Cef)和羧芐青霉素(Carb)質量濃度達到500 mg/L時，可以完全抑制農桿菌的生長，但通過試驗發(fā)現Cef對苜蓿子葉的誘導分化起抑制作用，但不影響植株的生根。所以，在本研究中苜蓿外植體與農桿菌共培養(yǎng)后，為了減少農桿菌的污染，在外植體誘導分化培養(yǎng)基上采取了先加500 mg/L Carb，然后在每次繼代時逐漸降低其質量濃度，最低時用100 mg/L的Carb來抑菌。獲得Kan抗性植株后，生根階段采用200 mg/L Cef就可以有效抑制農桿菌(圖2C)。

圖3 共培養(yǎng)時間對子葉愈傷誘導率的影響

2.3轉基因苜蓿分子生物學檢測

2.3.1轉基因苜蓿PCR檢測 以質粒pCAMBIA1300-HA的DNA為陽性對照，分別以非轉基因植株和無模板擴增為陰性對照，用HA基因特異性引物對Kan抗性植株DNA進行PCR擴增。從獲得的56株轉化苗中，有7株擴增出了大約697 bp的特異片段，陽性檢出率12.5%。檢測結果初步表明，HA基因已整合到受體苜?；蚪M中(圖4)。

圖4 部分轉基因植株PCR檢測

2.3.2轉基因植株PCR-Southern檢測 將PCR陽性植株和非轉基因植株的DNA經EcoRⅠ、XhoⅠ酶切后，進行瓊脂糖凝膠電泳，然后轉移到尼龍膜上，與以地高辛標記的HA基因特異PCR 產物進行分子雜交。結果顯示(圖5)，陰性對照無雜交條帶，陽性對照和轉化植株有明顯的雜交條帶，South-ern分子雜交結果進一步證明了HA抗原基因已整合到了紫花苜?；蚪M中。

圖5 轉基因植株PCR-Southern檢測

3 討論

苜蓿作為轉基因受體材料，其本身存在著體細胞胚誘導困難、分化率低、重復性差等問題，這就嚴格制約著轉化效率的提高[12-13]。為此，有必要針對特定基因型材料建立高頻再生體系對實現遺傳轉化至關重要。本研究中甘農1號紫花苜蓿7 d苗齡的子葉再生頻率顯著高于下胚軸，生長素2,4-D對誘導愈傷形成的作用明顯，6-BA和NAA的配合使用可提高子葉再生頻率，GA3可降低畸形苗的形成，促進植株正常生長發(fā)育。另外，影響遺傳轉化的因素很多，并且各因素之間存在交互作用。本研究優(yōu)化了紫花苜蓿遺傳轉化條件，確定菌液浸染濃度(OD600)為0.5，浸染時間為8～10 min，適宜的共培養(yǎng)時間為2 d，子葉誘導分化階段使用Carb抑菌，再生植株壯苗期間使用Cef有利于生根，最終獲得了經過分子鑒定的轉基因苜蓿植株。但與一些相關研究[14]相比，本研究中的轉化效率較低，原因是苜蓿外植體再生頻率存在基因型差異，甘農1號紫花苜蓿再生頻率低，嚴重制約著遺傳轉化效率。因此，需要從建立高頻再生體系方面加強研究。

轉基因苜蓿作為植物生物反應器具有操作方便、便于大面積推廣等許多潛在的優(yōu)勢，多數可直接飼用或食用。例如口蹄疫疫苗等可以免去提取、純化、注射等一系列過程，直接作為“口服疫苗”使用，為人類提供了一個更加安全和廉價的生產體系，展現出了非常廣闊的應用前景[15]。但是在轉基因苜蓿疫苗的研究中，抗原表達量低及遺傳穩(wěn)定性差是限制其規(guī)?；l(fā)展的主要問題。一般考慮選用合適的強啟動子、增強子和改造表達載體等方法，來提高外源基因在苜蓿體內的表達量[16]。本研究中獲得的轉基因苜蓿為皮蠅蛆病植物源疫苗的開發(fā)和應用奠定了研究基礎，但HA基因在苜蓿體內是否表達及在后代材料中遺傳穩(wěn)定性如何還有待進一步的研究。

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