西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院

郭少賢 劉永惠 常 靖△ 夏欣欣 王 瑞 華 莎 （西安 710061）

腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移,與腫瘤微環(huán)境有十分重要的關(guān)系,對腫瘤微環(huán)境的研究已成為目前研究的熱點之一,而腫瘤細胞持續(xù)缺氧可以誘導(dǎo)新生血管生成,可能為腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移提供一定的環(huán)境與條件?，F(xiàn)代中醫(yī)研究認為,腫瘤及其轉(zhuǎn)移存在血瘀證,與腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移存在正相關(guān)關(guān)系。為深入研究血瘀證與腫瘤微環(huán)境及腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移的關(guān)系,本實驗應(yīng)用麝香酮干預(yù)血瘀證裸鼠乳腺癌組織血管生成相關(guān)因子 VEGF、bFGF的表達,探討麝香酮對腫瘤微環(huán)境的影響,進一步闡述其抗腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移的作用機理。

1 材料與方法

1.1 動物與細胞系 雌性裸鼠40只,體重 （20±2）g,購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司,許可證號碼SCXK（滬）2007-0005,飼養(yǎng)于動物實驗室 SPF環(huán)境中。乳腺癌MDA231細胞株購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 藥物 麝香酮購自德國Dr（批號 90527CY）,腎上腺素購自上海禾豐制藥有限公司 （批號 H 31021062）。

1.3 儀器與試劑 SCW-BCM生物超凈工作臺系蘇州市長春電子儀器廠生產(chǎn);臺式多功能離心機系長沙市鑫奧儀器儀表有限公司生產(chǎn);普通光學顯微鏡購自日本 Olympus公司;電熱恒溫水浴箱 DR-HW-2購自北京西城區(qū)醫(yī)療器械廠;CO2細胞培養(yǎng)箱購自上海控菱科技有限公司;VEGF一抗及bFGF一抗購自北京康為世紀生物科技有限公司;VEGF二抗及bFGF二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4方法

1.4.1 細胞培養(yǎng):乳腺癌 MDA 231細胞株用含 10%胎牛血清的 RMPI1640培養(yǎng)液培養(yǎng),細胞長滿單層后用 0.25%胰酶消化,培養(yǎng)液吹打離心,收集細胞用 PBS稀釋,濃度調(diào)至 5×106。

1.4.2血瘀模型:將 40只裸鼠分成兩組,空白組 10只,皮下注射生理鹽水 0.2 mL/只,連續(xù) 7日;血瘀組 30只,皮下注射 0.01%腎上腺素 0.2mL/只,連續(xù) 7日。[1]

1.4.3 測定指標與方法:隨機選取血瘀組中 10只裸鼠和空白組 10只裸鼠,眼球取血脫臼處死。由于 1只裸鼠的血量不足 1個檢測樣本,故將同組的 2只裸鼠的血樣合并成 1個樣本,每組各為 5個樣本,由本院的檢驗科測定。全血黏度測定:取血 3mL,用適量肝素粉抗凝,在血液流變儀上,測定在切變率為 1S-1、5S-1、30S-1、200S-1的全血黏度。

1.4.4 接種與給藥:將其余 20只裸鼠,每只裸鼠于右后背部皮下接種細胞液 0.2mL。接種 10天腫瘤長至 1mm3時,隨機分為兩組,血瘀加瘤組 10只;麝香酮組 10只。給藥劑量均采用人與動物計量換算法確定。①血瘀加瘤組:每天灌胃生理鹽水 0.2 mL,連續(xù) 14天。②麝香酮組:麝香酮給予 2mg∕kg灌胃,連續(xù) 14天。

1.4.5 免疫組化:脫臼處死余下 20只裸鼠,取出瘤體,放入 4%多聚甲醛固定液中,經(jīng)組織脫水、透明、滲蠟、石蠟包埋,以 5μm厚度連續(xù)切片,免疫組化采用 SP法,按照試劑盒說明書檢測VEGF及 bFGF的表達。用PBS作為一抗做陰性對照。

1.4.6 結(jié)果判定:VEGF免疫組化染色以胞漿或胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性,結(jié)果評分,陽性細胞范圍分為 0～3級:無陽性細胞為 0,1%～10%為 1,11%～50%為2,51%以上為 3;染色強度分為 0～3級,陰性為 0,弱陽性為 1,中度陽性為 2,強陽性為 3,[2]兩者之和即為該片的 VEGF免疫組化評分,bFGF的表達也采用該評分標準。

2 結(jié)果

2.1 血液流變學 空白組與血瘀組血液流變學結(jié)果經(jīng)t檢驗后,兩組在 1S-1、5S-1、 30S-1、 200S-14個指標間差異均有顯著性 （P＜0.05）,可以認為兩組的全血黏度有差異,詳見表 1。

2.2 VEGF和bFGF在血瘀加瘤組、麝香酮中的表達情況 經(jīng) t檢驗后,麝香酮組與血瘀加瘤組比較差異均有顯著性 （P＜0.05）,詳見表 2。

表1 血液流變學結(jié)果 （±s）

表1 血液流變學結(jié)果 （±s）

指標 空白組 血瘀組1S-1 29.47±7.28 46.02±10.94 5S-1 9.66±2.71 14.54±3.08 30S-1 4.21±1.50 6.11±3.46 200S-1 2.09±1.34 3.97±1.67

表2 VEGF和 bFGF結(jié)果 （±s）

表2 VEGF和 bFGF結(jié)果 （±s）

指標 血瘀加瘤組 麝香酮組VEGF 5.34±0.23 2.90±0.25 bFGF 4.52±0.35 2.23±0.38

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤?，F(xiàn)代中醫(yī)研究認為,氣滯血瘀為其發(fā)生和發(fā)展的重要機制之一。研究表明腎上腺素多次小劑量皮下注射模擬長期肝氣不疏,氣滯不能行血,導(dǎo)致裸鼠全血黏度增高,血液處于黏、稠狀態(tài),形成血瘀證。[1]研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細胞生長的高代謝需求導(dǎo)致微環(huán)境出現(xiàn)缺氧,而血瘀證的病理基礎(chǔ)是血液凝固—纖溶—血小板功能紊亂,[3]加重腫瘤細胞微環(huán)境缺氧的狀態(tài)。缺氧誘導(dǎo)因子 （HIF-1）是細胞對于缺氧反應(yīng)的最基本物質(zhì)之一。它在惡性腫瘤中普遍存在,是缺氧誘導(dǎo)基因表達的中心調(diào)節(jié)因子,[4]表達受到缺氧、癌基因和抑癌基因、生長因子等多種因子的調(diào)節(jié),可調(diào)控有關(guān)腫瘤血管生成、能量代謝等多種靶基因的轉(zhuǎn)錄、促進腫瘤生長、浸潤和轉(zhuǎn)移。

H IF-1屬于 bHLH-PAS家族成員,是由 α亞單位（HIF-1α）和 β亞單位 （HIF-1β）組成的異源二聚體蛋白[5]。HIF-1β是許多bHLH蛋白的共同亞單位,不受氧水平的影響,在正常細胞和缺氧細胞的胞質(zhì)和胞核中均有表達;HIF-1α是唯一的氧調(diào)節(jié)亞單位,在常氧條件下,細胞雖不斷的合成 HIF-1α,但經(jīng) pVHL的介導(dǎo)而被泛素 -蛋白酶體系統(tǒng)迅速降解;在缺氧狀態(tài)下,由于不發(fā)生自身羥基化降解被阻止,轉(zhuǎn)入核內(nèi)與HIF-1β結(jié)合形成有活性的HIF-1,HIF-1通過與其靶基因的啟動子或增強子的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合而發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄活性,從而調(diào)節(jié)腫瘤細胞的缺氧效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn),大多數(shù)實體瘤 HIF-1蛋白高表達,如直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、腦腫瘤、腎臟腫瘤等,而在相鄰的正常組織或基質(zhì)細胞中均不能測及。H IF-1的表達程度與腫瘤的惡性程度、新生血管的表達程度、腫瘤的侵襲能力及預(yù)后不良成正相關(guān)。

惡性腫瘤在發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的過程中,新生血管形成及對缺氧的耐受性是至關(guān)重要的。H IF-1通過與有關(guān)腫瘤血管形成的基因結(jié)合,使其表達升高,VEGF和 bFGF在腫瘤新生血管形成中起關(guān)鍵作用。VEGF是最重要的促進腫瘤血管形成的因子,分為 VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盤生長因子 （PGF）,VEGF在正常成人組織呈低水平表達,但在腫瘤組織中呈高表達。VEGF結(jié)合受體FLt-1和KDR,直接誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞增殖、遷移,增加血管通透性,促使血漿纖維蛋白外滲,增加血管外纖維性凝膠從而支持內(nèi)皮細胞生長,有利于血管生成。[6]bFGF是目前已知最強的促血管形成因子之一,與細胞膜上受體結(jié)合,刺激內(nèi)皮細胞產(chǎn)生血漿素原激活物和膠原酶,降解血管基底膜;誘導(dǎo)血管內(nèi)皮長入膠原基質(zhì)中,形成和毛細血管類似的管腔;刺激平滑肌增殖,使新生血管成熟。

血瘀證與惡性腫瘤存在密切關(guān)系,研究表明,腫瘤血瘀證主要與腫瘤患者的微循環(huán)障礙,高凝狀態(tài),血小板功能紊亂相關(guān),同時與腫瘤新生血管等腫瘤微環(huán)境也存在重要關(guān)系。經(jīng)過長期中醫(yī)藥對腫瘤治療的臨床研究,發(fā)現(xiàn)活血化瘀藥物在防治腫瘤中起積極作用,通過影響血瘀證本質(zhì)即通過調(diào)節(jié)腫瘤患者血液凝固狀態(tài) -纖溶 -血小板的平衡,特別是可能抑制腫瘤血管生成而發(fā)揮其藥效。本實驗結(jié)果顯示麝香酮對腫瘤新生血管生成有明顯的抑制作用。麝香酮是麝香的主要活性成分,具有芳香行氣、通經(jīng)活絡(luò)、對抗缺氧損傷的功能。麝香酮通過芳香行氣的作用,活血化瘀,改善血液的 “高凝狀態(tài)”,降低血小板黏附、聚集,改善纖維蛋白含量,增加纖維蛋白溶解及血流量,[7]改善腫瘤細胞微環(huán)境缺氧的狀態(tài),使 HIF-1低表達,進而,VEGF和 bFGF表達減少,從而發(fā)揮抑制腫瘤新生血管生成的作用。目前麝香酮能抑制腫瘤的新生血管生成文獻報道較少。故這一重要研究結(jié)論預(yù)示麝香酮在抑制腫瘤新生血管生成中具有較好的應(yīng)用前景。

[1] 和嵐,蔣文躍,毛騰敏.注射腎上腺素模擬 “氣滯”復(fù)制急、慢性血瘀模型初探 [J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2004,24（3）:244-245

[2] 左朝輝,黎祖榮,周曉.環(huán)氧合酶 -2抑制劑塞來昔布對人肝癌 HepG2裸小鼠移植瘤生長和腫瘤血管生成的抑制作用[J].癌癥,2006,25（4）:414-420

[3] 劉永惠,楊曉峰,周冬枝 .腫瘤血瘀證實質(zhì)及活血化瘀治則的研究 [J].河北中醫(yī),2002,24（4）:252-254

[4] 王敬儉,李靜,耿美玉.靶向缺氧誘導(dǎo)因子 -1的抗腫瘤藥物研究進展 [J].藥學學報,2008,43（6）:565-569

[5] 朱小康,韓福生.缺氧誘導(dǎo)因子 -1在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展和治療中的作用 [J].蚌埠醫(yī)學院學報,2010,35（2）:211-214

[6] 廖子君,雷光焰.腫瘤轉(zhuǎn)移學 [M].西安:陜西科學技術(shù)出版社,2007.165-171

[7] 劉永惠,鄧景元,鄒鵬 .張玉五教授治療腫瘤學術(shù)思想探究 [J].河北中醫(yī)藥學報,2006,21（4）:31-33

（2011-04-22 收稿）