呂敬媛,王 丹,趙玉楠

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科,黑龍江佳木斯 154003)

妊娠期高血壓疾病(hypertensive disorders in pregnancy)是妊娠期特有的疾病。該病嚴重影響母嬰健康,是孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒病率和病死率的主要原因。至今病因未明[1]。從免疫學觀點看,妊娠被認為是成功的自然同種異體移植,正常妊娠的維持有賴于胎兒母體間免疫平衡的建立和穩(wěn)定,如這種平衡被打破,即可導致發(fā)生免疫排斥反應,從而引起一系列的血管內(nèi)皮細胞損傷,進而發(fā)生妊娠期高血壓疾病[2～4]。PD-1作為新近發(fā)現(xiàn)的 CD28家族重要成員,已被證實通過抑制T細胞的活化和增殖來負調(diào)控免疫應答[5],并且在調(diào)節(jié)免疫耐受以及腫瘤免疫逃逸等中發(fā)揮重要作用。因此,本研究用流式細胞術(shù)測定妊娠期高血壓疾病患者外周血和雙陽性細胞比例,探討PD-1在妊娠期高血壓疾病發(fā)病中的作用及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

所有對象均選取2009—07～2010—06在我院婦產(chǎn)科就診及住院的妊娠婦女。其中妊娠期高血壓疾病患者37例,平均年齡(26.4±4.2)歲,平均孕齡(35.3±4.1)周。包括重度子癇前期患者10例,輕度子癇前期患者12例,妊娠期高血壓患者15例,正常妊娠組15例,平均年齡(25.2±3.7)歲,平均孕齡(36.5±4.6)周。各組病例年齡及孕齡比較均無顯著性差異。診斷及分類標準根據(jù)樂杰主編《婦產(chǎn)科學》第7版[1]。孕婦均為初孕婦單胎妊娠,既往無原發(fā)性高血壓、糖尿病史,無反復流產(chǎn)史,心肝肺腎功能正常,未經(jīng)生殖技術(shù)幫助,無免疫性疾病,未經(jīng)免疫藥物治療。

1.2 實驗試劑

流式細胞檢測所用單抗及同型對照抗體:PE-cy5標記人CD4單抗,FITC標記人PD-l單抗;PE-cy5標記人和FITC標記人IgGI同型對照抗體,均購自EB公司。

1.3 方法

1.3.1 血標本采集及外周血PBMC分離

分別抽取各組研究對象前臂肘靜脈血3mL(妊娠期高血壓疾病患者均于住院治療前抽血),采用葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法分離外周血單個核細胞。將制成的單個核細胞懸液在12h內(nèi)送流式檢驗和雙陽性細胞百分比。

取單個核細胞懸液,將其分成4份,每份150μ L,加流式單抗或同型對照抗體:(l)空白管:加20μ L PBS;(2)同型對照1:加10μ L PE-Cy5標記人CD4單抗和10μ L FITC 標記人同型對照抗體;(3)同型對照2:加 10μ L PE-Cy5標記人同型對照抗體和 10μ L FITC標記人 PD-1單抗;(4)測定管:加PE-Cy5標記人CD4單抗以及FITC標記人PD-1單抗。4℃孵育30min,加1mL PBS1000r/min離心8min洗滌,共洗滌二次;加200μ L PBS重懸細胞,上機檢測。以各自的同型對照管參數(shù)設門,將測定管參數(shù)減去同型對照背景,則為測定管參數(shù)值。以相關(guān)配套軟件計算和+雙陽性細胞比例,結(jié)果以百分比(%)表示。

1.4 統(tǒng)計學處理

實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差(±s)表示,以SPSS13.0軟件中的單因素方差分析(One-Way ANOVA),各組兩兩比較用q檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

表1 各組PBMC中CD4+和CD4+PD-1+細胞比例(±s)

表1 各組PBMC中CD4+和CD4+PD-1+細胞比例(±s)

★與正常妊娠組相比(P＜0.05),▲ 與妊娠期高血壓組相比(P＜0.05),● 與輕度子癇前期組相比(P＜0.05)。

組 別 n CD+4(%) CD+4PD-1+(%)正常妊娠組 15 21.87±1.23 3.89±0.73妊娠期高血壓組 15 21.90±1.20 9.50±1.02★輕度子癇前期組 12 22.80±0.91★▲ 17.90±2.13★▲重度子癇前期組 10 25.27±0.99★▲● 25.60±3.02★▲●

3 討論

從現(xiàn)代免疫學觀點看,妊娠是母胎免疫系統(tǒng)相互作用的過程,胎兒攜帶有父源性抗原,對母體的免疫系統(tǒng)來說是一種半同種移植物,正常妊娠是母體免疫系統(tǒng)對胎兒的免疫耐受過程。一旦母胎間免疫耐受平衡失調(diào),便可導致免疫排斥反應,從而發(fā)生妊娠失敗及某些妊娠并發(fā)癥,如妊娠期高血壓疾病、習慣性流產(chǎn)等。目前大量的研究表明妊娠期高血壓疾病與免疫系統(tǒng)存在密切的關(guān)系。在妊娠期高血壓疾病形成過程中,免疫系統(tǒng)和免疫細胞起到了重要作用。在妊娠期高血壓疾病形成和演變中不同的T淋巴細胞亞群起不同的作用,其中對其發(fā)生起優(yōu)勢作用的T細胞類型是CD4陽性T輔助細胞(Th)。PD-1是表達在激活狀態(tài)的 T、B細胞上的一種協(xié)同性信號調(diào)節(jié)分子,屬于免疫球蛋白(Ig)超家族成員,與以前發(fā)現(xiàn)的CTLA-4有相似性,屬于負性調(diào)控的協(xié)同信號分子,表現(xiàn)對激活后T、B細胞炎癥程度的下調(diào)和炎癥范圍的限制[6]。與CT LA-4表達時限的區(qū)別是PD-1表達的時限相對較晚,持續(xù)時間長,現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)PD-1多表達在慢性感染性疾病或者自身免疫性疾病的炎性細胞表面,其配體主要有PD-Ll和PD-L2,PD-1與其配體結(jié)合后介導對免疫細胞周圍性耐受,能下調(diào)其炎癥反應程度。缺乏PD-1受體的T淋巴細胞(無論是還是細胞)的增殖能力和分泌細胞因子功能均顯著增強,并且基本不表現(xiàn)凋亡,不能介導周圍性耐受[7]。PD-1在妊娠期高血壓疾病病人外周血PBMC中的表達情況,目前尚無明確結(jié)果。本研究用流式細胞方法測定了妊娠期高血壓疾病患者外周血PBMC中CD4和PD-1的表達水平,并與正常妊娠組進行了對比分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),妊娠期高血壓疾病患者細胞比例增多,重度子癇前期組患者其比例增加更明顯,與文獻報道結(jié)果一致。與其他報道不同的是,本研究檢測了不同類型的妊娠期高血壓疾病患者外周血細胞上PD-l表達的水平,即 PBMC中比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常妊娠組比較,在妊娠期高血壓疾病各組雙陽性細胞比例均較對照組增高,由文獻可知PD-l是在T細胞激活以后表達的負性調(diào)控表面分子,故結(jié)合本研究結(jié)果推測細胞高表達PD-1其作用可能是反饋性抑制細胞的過度激活。這對深入研究妊娠期高血壓疾病的機制展現(xiàn)了一個窗口,對臨床治療提供了一個潛在的靶標。但是PD-1對妊娠期高血壓疾病影響的直接證據(jù)還有賴于進一步的研究。

[1]樂杰主編.婦產(chǎn)科學[M].第7版,北京:人民衛(wèi)生出版社,2008,92-94

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