東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 張曉烜 王傲雪*

纖維素是自然界中存在最廣泛的一類碳水化合物，也是地球上數(shù)量最大的可再生資源。目前，自然界中的纖維素只有一小部分得到了利用，絕大多數(shù)纖維素被白白浪費(fèi)掉，而且還造成了環(huán)境污染。利用微生物生產(chǎn)的纖維素酶將纖維素轉(zhuǎn)化為人類急需的能源、食物、飼料和化工原料等，對(duì)解決環(huán)境污染、食物短缺和能源危機(jī)具有重大的現(xiàn)實(shí)意義（馬旭光等，2006）。要使纖維素酶真正能夠用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，首先要降低纖維素酶的成本，新菌株的選育是纖維素酶科學(xué)研究的一個(gè)重要課題，誘變育種是其中的重要方法（汪維云等，1998）。纖維素酶產(chǎn)生菌主要有木霉、青霉和曲霉等，其中里氏木霉對(duì)牲畜無毒害作用，且其生產(chǎn)條件比較容易控制。但目前是高產(chǎn)纖維素酶的里氏木霉菌株較少（徐昶，2005）。本文利用三種誘變因子對(duì)里氏木霉40359進(jìn)行高產(chǎn)纖維素酶的選育，得到了一株穩(wěn)定高產(chǎn)的菌株YB40359。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備 里氏木霉菌株40359（購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心）。馬鈴薯、小麥麩皮、（市售）葡萄糖、瓊脂、蛋白胨、酵母膏、微晶纖維素、剛果紅染料、脫氧膽酸鈉、羧甲基纖維素鈉、KH2PO4、（NH4）2SO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、Tween-80、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、CoCl2·6H2O、NaNO2、DES（硫酸二乙酯），3，5-二硝基水楊酸（DNS）、酒石酸鉀鈉、結(jié)晶酚、無水亞硫酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、羧甲基纖維素鈉、水楊酸苷（所有試劑均為分析純）、新華定量濾紙。

培養(yǎng)皿、培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、搖床、恒溫水浴鍋、離心機(jī)、720型分光光度、20 W紫外照射儀、磁力攪拌器、手提式壓力滅菌器。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng) 將提純復(fù)壯后的里氏木霉40359（經(jīng)傳代試驗(yàn)酶活穩(wěn)定）接種在PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)6 d后備用。

1.2.2 培養(yǎng)基配制 菌種斜面復(fù)活培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基；平皿初篩培養(yǎng)基（剛果紅瓊脂培養(yǎng)基）上層培養(yǎng)基：微晶纖維素（或羧甲基纖維素鈉）1%、纖維二糖1%～2%、瓊脂2%、脫氧膽酸鈉0.12%、剛果紅0.01%，溶于Mandel’s營(yíng)養(yǎng)液中；下層培養(yǎng)基：2% 的瓊脂溶于 Mandel’s營(yíng)養(yǎng)液中；液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨0.3%，硫酸銨0.2%，酵母膏 0.05%，KH2PO40.4%，CaCl2·2H2O 0.03%，MgSO4·7H2O 0.03%，Tween-80 0.02%，微晶纖維素2%，小麥麩皮3%，121℃滅菌20 min后使用。

1.2.3 誘變劑及誘變劑量的選擇 紫外線誘變將培養(yǎng)好斜面菌種用無菌水洗下孢子，調(diào)整孢子濃度為107。開啟紫外燈預(yù)熱30 min，取3 mL制備好的孢子液于無菌培養(yǎng)皿中（?6 cm）中，紫外燈功率為20 W，照射距離為30 cm，分別照射5、10、15、20、25 min。將照射后的菌液稀釋成不同梯度后，各取0.1 mL均勻涂布于剛果紅培養(yǎng)基平板上，在皿蓋上標(biāo)明稀釋度及輻照時(shí)間，用報(bào)紙包起黑暗培養(yǎng)24 h，后打開報(bào)紙進(jìn)行培養(yǎng)。取未經(jīng)紫外線照射的孢子液，稀釋相同梯度涂于剛果紅培養(yǎng)基，作為對(duì)照。

紫外線和亞硝酸鈉復(fù)合誘變：將經(jīng)紫外線誘變篩選的菌株斜面培養(yǎng)，分別用10 mL無菌生理鹽水將孢子洗下，振蕩，血球記數(shù)板記數(shù)，調(diào)整孢子濃度為108個(gè)/mL菌液。取1 mL菌液，分別用0.1 mol/L 的亞硝酸鈉 2 mL 處理 3、5、8、10、13、15、18 min后，加無菌生理鹽水大量稀釋終止反應(yīng)。將不同處理的菌液稀釋不同濃度后，用移液槍各移取0.1 mL涂布接種于剛果紅培養(yǎng)基，黑暗培養(yǎng)1 d，后打開報(bào)紙。取未經(jīng)亞硝酸鈉處理的孢子液，稀釋相同梯度涂于剛果紅培養(yǎng)基作為對(duì)照。

紫外線、亞硝酸鈉與硫酸二乙酯（DES）的復(fù)合誘變：用無菌生理鹽水10 mL將經(jīng)過紫外線和亞硝酸鈉復(fù)合誘變后篩選出的斜面菌株洗下，振蕩均勻，調(diào)整孢子數(shù)目至106個(gè)/mL菌液，取1 mL菌液加入 0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mL 硫酸二乙酯，振蕩，使之分布均勻，30 min后，無菌生理鹽水大量稀釋終止反應(yīng)，將處理后的菌液稀釋不同濃度后，各取0.1 mL反應(yīng)后的菌液涂布接種于剛果紅瓊脂平板，暗培養(yǎng)10 h，后正常培養(yǎng)。確定硫酸二乙酯的用量。取未經(jīng)硫酸二乙酯處理的孢子液，稀釋相同梯度涂于剛果紅培養(yǎng)基作為對(duì)照。

1.2.4 初選 將誘變得到的孢子液涂布于剛果紅培養(yǎng)基，28℃，培養(yǎng)3～5 d，挑取透明圈直徑/菌落直徑（H/C）大的平板菌落作為菌種。移接到三角瓶中，經(jīng)180 r/min，28℃，6 d搖瓶培養(yǎng)后，測(cè)定濾紙酶活，酶活較高的菌株作為初篩優(yōu)良菌株。

1.2.5 復(fù)篩 把初篩的優(yōu)良菌株（選取透明圈出現(xiàn)較早，H/C較大的菌株）接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基三角瓶中，經(jīng)180 r/min，28℃，6 d搖瓶培養(yǎng)后，測(cè)定濾紙酶活和CMC酶活，與對(duì)照組相比，菌株發(fā)酵液酶活力≤90%的為負(fù)突變株，酶活力≥110%的為正突變株，酶活力在90%～110%的為非變異株。把酶活較高的菌株作為復(fù)篩的優(yōu)良菌株，將其命名為YB40359。正突變率（初篩）=誘變后H/C大于出發(fā)菌株的菌落總數(shù)／誘變后存活的菌落總數(shù)100%。

1.2.6 酶活測(cè)定 粗酶液的制備 將液體搖瓶發(fā)酵得到的液體轉(zhuǎn)移到無菌的1.5 mL離心管中，6000 r/min離心5 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，備用。羧甲基纖維素酶活（CMCase）、濾紙?zhí)敲富睿‵PA，F(xiàn)Pase）的測(cè)定 參考吳丹（2007）。 酶活的計(jì)算方法：

式中：5.56為 1 mg葡萄糖的μmol數(shù)（1000/180=5.56）。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外線最適劑量的選擇 由圖1可知，隨著紫外線的輻照時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株的死亡率逐漸上升，存活曲線呈現(xiàn)指數(shù)型的“肩型”。照射15 min時(shí)其存活率只有13.28%；30 min的照射幾乎沒有存活的菌體，致死率最大，達(dá)到了99.63%。而其正突變率則有先升后降的趨勢(shì)，其中照射15 min時(shí)，菌株致死率為86.62%；初篩正突變率最高為7.60%，所以初步選擇15 min為UV誘變照射時(shí)間。

圖1 出發(fā)菌株的紫外線輻照誘變

2.2 亞硝酸鈉最適劑量的確定 選擇經(jīng)UV輻照后篩選出的優(yōu)良菌株，取1 mL孢子液加入0.1 mol/L的亞硝酸鈉2 mL，25℃處理不同時(shí)間（圖2）。試驗(yàn)結(jié)果表明，在NaNO2處理15 min時(shí)，菌體的死亡率87.59%；正突變率最高為9.37%。

圖2 亞硝酸鈉的誘變效果

2.3 DES最適劑量的確定 取里氏木霉40359經(jīng)UV輻照和NaNO2處理后選育出的優(yōu)良菌株，取1 mL孢子液再經(jīng)DES處理（圖3）。由試驗(yàn)結(jié)果可以看到，DES+UV+NaNO2協(xié)同對(duì)里氏木霉40359的損壞致死作用較大，DES、NaNO2破壞細(xì)胞染色體的堿基的能力強(qiáng)，導(dǎo)致DNA多點(diǎn)突變。用較少的劑量，細(xì)胞的死亡率就已經(jīng)很高，采用不同DES劑量，相同時(shí)間處理（30 min）。當(dāng)在1 mL菌液里加入0.06 mLDES時(shí)，致死率達(dá)到94.36%，正突變率較高達(dá)到11.08%。

2.4 初篩 本試驗(yàn)利用UV（20 W，30 cm處，輻照 15 min），0.1 mol/L NaNO2處 理 15 min，0.06 mL DES處理30 min的協(xié)同、多輪復(fù)合誘變。誘變菌株在剛果紅平板上透明圈出現(xiàn)時(shí)間較快，H/C也較大，屬于正常突變株。大部分再生菌株的生長(zhǎng)不旺盛，產(chǎn)孢量少，顏色黃綠色，淺于出發(fā)菌株。根據(jù)篩選平板上出現(xiàn)水解圈的情況，挑取在剛果紅平板上菌落凸起、黃綠色、H/C較大的菌株，作為產(chǎn)酶初篩菌株。

圖3 硫酸二乙酯的誘變效果

2.5 復(fù)篩 經(jīng)過初篩共得到40個(gè)菌株，將初篩得到的菌株用接種針點(diǎn)接種于馬鈴薯培養(yǎng)基平板上，活化復(fù)壯菌種，以未經(jīng)過誘變的菌株作為對(duì)照。分別接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基28℃、180 r/min，培養(yǎng)144 h后測(cè)定酶活。由于里氏木霉的β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量較小，所以在復(fù)篩過程中沒有測(cè)其含量。

由表1可以看出，在40株初篩突變菌株中，有3株負(fù)突變株，占7.5%；有4株非變異株，占10%；有33株正突變株，占82.5%。（對(duì)照1為野生菌株，對(duì)照2為經(jīng)紫外線和亞硝酸鈉誘變后的菌株 40359 b）。

將所有正突變株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果表明28號(hào)菌株的搖床發(fā)酵液的酶活力較高，且在連續(xù)7代試驗(yàn)遺傳穩(wěn)定性較好，命名為YB 40359，作為生產(chǎn)菌株。

表1 誘變菌株生產(chǎn)纖維素酶的能力 U/mL

由表2可知，28號(hào)菌株發(fā)酵培養(yǎng)后，F(xiàn)PA酶活力達(dá)到57.31 U/mL，較原始菌株提高了87.12%；CMC酶活達(dá)到142.60 U/mL，較原始菌株提高了58.66%。

表2 誘變菌株YB 40359遺傳穩(wěn)定性狀的檢測(cè) U/mL

3 結(jié)論

3.1 紫外線、亞硝酸鈉和硫酸二乙酯最適劑量的確定 里氏木霉40359的紫外線最適劑量為：紫外燈20 W、照射距離30 cm、輻照時(shí)間15 min；亞硝酸鈉的最適劑量為 0.1 mol/L、25℃處理 15 min；硫酸二乙酯0.06 mL處理30 min。

3.2 里氏木霉40359誘變選育結(jié)果 本研究采用紫外線、亞硝酸鈉和硫酸二乙酯對(duì)里氏木霉40359進(jìn)行低劑量復(fù)合誘變，經(jīng)過反復(fù)誘變得到高產(chǎn)纖維素酶菌株YB40359，液體搖瓶試驗(yàn)表明：其發(fā)酵培養(yǎng)后，F(xiàn)PA酶活力達(dá)到57.31 U/mL，較原始菌株提高了87.12%；CMC酶活達(dá)到142.60 U/mL，較原始菌株提高了58.66%，可作為纖維素酶生產(chǎn)菌株。

[1]馬旭光，張宗舟，藺海明，等.黑曲霉產(chǎn)高酶活纖維素酶突變株ZM-8的篩選[J].飼料工業(yè)，2006，27（24）：11 ～13

[2]汪維云，朱金華，吳守一.纖維素科學(xué)及纖維素酶的研究進(jìn)展[J].江蘇理工大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，19（3）：20 ～28

[3]徐昶,龍敏南,鄔小兵,等.高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及產(chǎn)酶條件研究[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005，44（1）：107 ～111.

[4]吳丹.高產(chǎn)纖維素酶菌株的分離鑒定，誘變選育及產(chǎn)酶條件的研究：[碩士研究生論文][D].南昌：南昌大學(xué)，2007，6：19 ～20.