吳濟(jì)南，王麗玲，王惟帥，杜慧玲

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院，030801，山西太谷)

土壤酶是催化有機(jī)物分解的一類(lèi)具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的生物催化劑，土壤酶主要來(lái)源于土壤微生物和植物根系的分泌物及動(dòng)植物殘?bào)w分解釋放的酶［1］，參與土壤中各種有機(jī)質(zhì)的分解、合成與轉(zhuǎn)化，以及無(wú)機(jī)物質(zhì)的氧化與還原等過(guò)程，是土壤生態(tài)系統(tǒng)代謝的一類(lèi)重要?jiǎng)恿Γ诤艽蟪潭壬戏从惩寥牢镔|(zhì)循環(huán)與轉(zhuǎn)化的強(qiáng)度，常被用來(lái)作為土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的預(yù)警和敏感指標(biāo)［2］。而土壤酶活性易直接或間接受自然或者人為因素的影響［3］。農(nóng)藥是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最常見(jiàn)的一種異源物質(zhì)，很容易影響土壤酶活性［4］，因此，土壤酶活性作為一項(xiàng)生態(tài)毒理學(xué)指標(biāo)，可用來(lái)判斷外來(lái)物質(zhì)對(duì)土壤的污染程度以及可能對(duì)生態(tài)環(huán)境造成的影響。

苯磺隆(Tribenuron-methyl)由芳環(huán)、磺酰脲橋和三嗪環(huán)組成，為內(nèi)吸傳導(dǎo)型選擇性磺酰脲類(lèi)除草劑，于20世紀(jì)80年代由美國(guó)杜邦公司開(kāi)發(fā)，具有高效、廣譜、用量少、使用方便、低殘留等優(yōu)點(diǎn)，是目前麥田廣泛使用的除草劑之一。多效唑?yàn)榈投局参锷L(zhǎng)延緩劑，能夠抑制莖桿伸長(zhǎng)，縮短節(jié)間，增加作物抗倒伏能力和抗逆性。在小麥生產(chǎn)上，為有效防止小麥后期倒伏，為小麥的高產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，常使用多效唑和追施尿素方法。杜慧玲等［5］通過(guò)盆栽試驗(yàn)研究了苯磺隆對(duì)土壤酶活性的影響，結(jié)果表明，土壤脲酶活性對(duì)表征苯磺隆污染具有一定的指示作用。王正貴等［6］研究了除草劑苯磺隆對(duì)麥田土壤酶活性的影響。而苯磺隆與多效唑、尿素配施對(duì)土壤酶活性的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者采用盆栽試驗(yàn)，研究除草劑苯磺隆與多效唑、尿素配施對(duì)土壤脲酶、堿性磷酸酶和蛋白酶的影響，旨在為環(huán)境質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)體系的建立以及經(jīng)濟(jì)合理地使用苯磺隆，減少環(huán)境污染提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 研究區(qū)概況

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)地位于晉中盆地的太谷縣，E 112.57°，N 37.43°，屬暖溫帶大陸性氣候，年平均氣溫9.8℃，無(wú)霜期175 d，降雨量462.9 mm，地下水資源可開(kāi)采量9 600 m3。農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)條件好。試驗(yàn)地為石灰性褐土，質(zhì)地為中壤，未使用過(guò)除草劑。

2 材料與方法

2.1 供試材料

供試土壤采自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)地。土壤理化性狀為:有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)16.85 g/kg，全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.96 g/kg，堿解氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)12.87 mg/kg，有效磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)15.58 mg/kg，速效鉀129.41 mg/kg，pH值8.3。采集0～20 cm土壤，晾干后過(guò)3 mm篩，充分混勻，選擇30 cm×26 cm的塑料盆，每盆裝土15 kg。

供試冬小麥(Triticum aestivum)品種為農(nóng)大190，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)提供;10%苯磺隆可濕性粉劑，沈陽(yáng)化工院生產(chǎn);15%多效唑可濕性粉劑由江蘇鹽城市磺隆實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn);尿素(N≥46%)由山西焦化集團(tuán)有限公司生產(chǎn)。

2.2 測(cè)定方法

脲酶活性采用苯酚鈉比色法測(cè)定;蛋白酶活性采用茚三酮顯色比色法測(cè)定;磷酸酶采用磷酸苯二鈉比色法測(cè)定［1］。

2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施

試驗(yàn)采用3因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，其中苯磺隆有3個(gè)水平(B、B1和B2，分別為0、5.0和100.0 mg/kg)，多效唑有2個(gè)水平(X和X1，分別為0和750 g/hm2)，尿素有2個(gè)水平(N和N1，分別為0和300 kg/hm2)，共12個(gè)處理組合:1)對(duì)照(B=0，X=0，N=0)(CK);2)低濃度苯磺隆(B1);3)高濃度苯磺隆(B2);4)多效唑(X1);5)低濃度苯磺隆+多效唑(B1X1);6)高濃度苯磺隆+多效唑(B2X1);7)尿素(N1);8)低濃度苯磺隆+尿素(B1N1);9)高濃度苯磺隆+尿素(B2N1);10)多效唑+尿素(X1N1);11)低濃度苯磺隆+多效唑+尿素(B1X1N1);12)高濃度苯磺隆+多效唑+尿素(B2X1N1)。每個(gè)處理3次重復(fù)。

于小麥返青后拔節(jié)前按試驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度噴施，處理后1、3、7、14、28、60 d 進(jìn)行采樣，測(cè)定土壤脲酶、堿性磷酸酶、蛋白酶活性。

2.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 8.1軟件進(jìn)行方差分析，用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行平均數(shù)的顯著性檢驗(yàn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 尿素、多效唑配施對(duì)苯磺隆脅迫下土壤脲酶的影響

由土壤脲酶方差分析結(jié)果表1可以看出，用藥后1～60 d，苯磺隆、多效唑(除第3 d)、尿素的主效應(yīng)對(duì)土壤脲酶活性的影響達(dá)極顯著差異水平，苯磺隆與尿素二因素以及苯磺隆、多效唑與尿素3因素互作除第1 d外均達(dá)極顯著差異水平。

表1 土壤脲酶方差分析結(jié)果Tab.1 F-value variance analysis results on soil urease

尿素、多效唑配施對(duì)苯磺隆脅迫下土壤脲酶活性的影響，各處理之間的多重比較結(jié)果見(jiàn)表2?？梢钥闯?與對(duì)照相比，B1、B2處理，在最初14 d呈抑制效應(yīng)，且抑制作用隨著苯磺隆濃度的增大而增大，1～7 d抑制率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，第7 d達(dá)到最大，分別為59.4%和74.8%;28～60 d呈激活效應(yīng)，第60 d，B1處理基本恢復(fù)到對(duì)照水平，B2處理極顯著地高于對(duì)照，激活率高達(dá)183.0%;B1X1處理在1～7 d表現(xiàn)為抑制效應(yīng)，抑制效應(yīng)小于B1處理，14～60 d呈激活效應(yīng)，比B1處理激活效應(yīng)提前;B2X1處理與B2處理相比，在第3 d和第7 d抑制率顯著提高，第3 d由60.0%提高為78.8%，第7 d由74.8%提高為88.0%，第60 d激活率為109.2%，小于B2處理;B1N1處理，除第1 d呈輕微的抑制效應(yīng)外，第3～60 d均呈激活效應(yīng)，差異水平達(dá)極顯著;B2N1處理在1～7 d呈較弱的抑制效應(yīng)，之后呈極顯著的激活效應(yīng);B1N1X1與B1相比，B2N1X1與B2相比，同一時(shí)間酶活性均顯著增加。在整個(gè)處理過(guò)程，與對(duì)照相比，B1和B2脲酶活性平均增加了-11.0%和 -7.27%，而B(niǎo)1N1X1和B2N1X1處理，脲酶活性平均增加29.8%和38.4%。說(shuō)明配施尿素和多效唑，可以緩解甚至消除苯磺隆對(duì)脲酶活性的抑制作用。

表2 不同處理間土壤脲酶多重比較結(jié)果Tab.2 Multiple comparisons results of soil urease between different treatments mg/(g·h)

3.2 尿素、多效唑配施對(duì)苯磺隆脅迫下土壤堿性磷酸酶的影響

土壤磷酸酶有酸性、中性和堿性3類(lèi)，測(cè)定的最適pH值分別為5.0、7.0和9.8。由于供試土壤為石灰性堿性土壤，故只進(jìn)行了堿性磷酸酶的研究。

土壤堿性磷酸酶方差分析結(jié)果表3表明，1～60 d，苯磺隆對(duì)土壤堿性磷酸酶活性的主效應(yīng)以及苯磺隆與尿素2因素互作均達(dá)顯著或極顯著差異水平，苯磺隆與多效唑互作除第1 d和第28 d，多效唑與尿素互作除第60 d不顯著外，其余時(shí)間均達(dá)顯著或極顯著水平，苯磺隆、多效唑與尿素3因素互作在處理的最初7 d達(dá)極顯著。

表3 土壤堿性磷酸酶方差分析結(jié)果Tab.3 F-value variance analysis results on soil alkaline phosphatase

尿素、多效唑配施對(duì)苯磺隆脅迫下土壤堿性磷酸酶的影響，各處理之間的多重比較結(jié)果見(jiàn)表4?？芍?低濃度苯磺隆對(duì)堿性磷酸酶活性表現(xiàn)為激活—抑制—激活作用，高濃度苯磺隆表現(xiàn)為抑制—激活作用，第60 d極顯著地高于對(duì)照，是對(duì)照的2.49倍;尿素、多效唑配施后表現(xiàn)為抑制—激活作用，各處理在第1～28 d堿性磷酸酶活性隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，其中14～28 d磷酸酶活性變化不大，之后急劇降低，處理結(jié)束時(shí)極顯著地高于對(duì)照;在整個(gè)處理過(guò)程中，與對(duì)照相比，B1、B1X1、B1N1、B1N1X1各處理堿性磷酸酶活性平均增加分別為3.22%、1.39%、-2.42%、-4.88%，B2、B2X1、B2N1、B2N1X1各處理堿性磷酸酶活性平均增加為-9.79%、-2.39%、3.95%、-4.56%。說(shuō)明低濃度苯磺隆對(duì)堿性磷酸酶具有激活效應(yīng)，配施尿素和多效唑，低濃度苯磺隆與尿素和多效唑表現(xiàn)為拮抗作用，減弱了其激活效應(yīng);高濃度苯磺隆對(duì)堿性磷酸酶具有抑制作用，尿素、多效唑可以緩解甚至消除高濃度苯磺隆對(duì)堿性磷酸酶活性的抑制作用，高濃度苯磺隆與多效唑表現(xiàn)為拮抗作用，與尿素表現(xiàn)為加和作用。

表4 不同處理間土壤堿性磷酸酶多重比較結(jié)果Tab.4 Multiple comparisons results of soil alkaline phosphatase between different treatments μg/(g·h)

3.3 尿素、多效唑配施對(duì)苯磺隆脅迫下土壤蛋白酶的影響

土壤蛋白酶方差分析結(jié)果見(jiàn)表5?？梢钥闯?，苯磺隆、尿素、多效唑主效應(yīng)以及交互效應(yīng)對(duì)土壤蛋白酶的影響在不同處理時(shí)間大多不顯著，特別是第1 ～7 d。

尿素、多效唑配施對(duì)苯磺隆脅迫下土壤蛋白酶的影響，各處理之間的多重比較結(jié)果見(jiàn)表6?？芍?除B1和B1N1處理外，其余苯磺隆以及苯磺隆配施尿素、多效唑各處理對(duì)土壤蛋白酶活性的影響表現(xiàn)為先抑制后激活，B1處理表現(xiàn)為激活—抑制作用，直到處理結(jié)束還沒(méi)有恢復(fù)到對(duì)照水平;B1N1處理第1天表現(xiàn)為極顯著的激活作用，之后為抑制作用;B2X1處理在第28天酶活性最強(qiáng)，與對(duì)照相比激活率為65.94%。在整個(gè)處理過(guò)程中，與對(duì)照相比，各處理酶活性平均降低順序?yàn)锽1N1(6.92%)＜B1X1(7.07%)＜B1(8.37%)＜B1N1X1(20.26%)。說(shuō)明低濃度苯磺隆同時(shí)與尿素和多效唑施用對(duì)土壤蛋白酶抑制作用增強(qiáng)，第7天抑制作用最強(qiáng)，抑制率為59.74%，低濃度苯磺隆與尿素和多效唑表現(xiàn)為拮抗作用。高濃度苯磺隆各處理酶活性與對(duì)照相比平均降低順序?yàn)锽2X1(0.00%)＜B2N1X1(2.54%)＜B2N1(9.61%)＜B2(25.1%)。說(shuō)明高濃度苯磺隆配施尿素、多效唑顯著降低了對(duì)土壤蛋白酶的抑制作用，高濃度苯磺隆與尿素表現(xiàn)為協(xié)同作用，與多效唑表現(xiàn)為拮抗作用。

表5 土壤蛋白酶方差分析結(jié)果Tab.5 F-value variance analysis results on soil protease

表6 不同處理間土壤蛋白酶多重比較結(jié)果Tab.6 Multiple comparisons results of soil protease between different treatments μg/(g·h)

4 結(jié)論與討論

1)在整個(gè)處理過(guò)程中，苯磺隆與尿素和多效唑配施對(duì)脲酶活性表現(xiàn)為先抑制后激活，且隨著濃度增加抑制和激活增強(qiáng)。與對(duì)照相比，對(duì)于脲酶活性主要表現(xiàn)為激活效應(yīng)，具體順序?yàn)?B2N1X1＞B1N1X1＞B1N1＞B2N1＞B1X1＞B2X1＞B1＞B2。

2)堿性磷酸酶活性表現(xiàn)為高濃度苯磺隆具有抑制作用，低濃度苯磺隆具有輕微的激活效應(yīng)。低濃度苯磺隆與尿素、多效唑混用酶活性降低，酶活性平均增加順序?yàn)?尿素(9.14%)＞尿素+多效唑(7.27%)＞低濃度苯磺隆(3.22%)＞低濃度苯磺隆+多效唑(1.39%)＞低濃度苯磺隆+尿素(-2.42%)＞多效唑(-4.70%)＞低濃度苯磺隆+尿素+多效唑(-4.88%)。高濃度苯磺隆與尿素、多效唑混用減弱了對(duì)酶活性的抑制作用，順序?yàn)?尿素(9.14%)＞尿素+多效唑(7.27%)＞高濃度苯磺隆+尿素(3.95%)＞高濃度苯磺隆+多效唑(-2.39%)＞高濃度苯磺隆+尿素+多效唑(-4.56%)＞多效唑 (-4.70%)＞高濃度苯磺隆(-9.79%)。

3)苯磺隆對(duì)土壤蛋白酶活性表現(xiàn)為抑制作用，且隨著濃度的增大抑制作用增強(qiáng)，B1、B2處理平均抑制率分別為8.37%和25.08%。添加多效唑、尿素(除B1X1N1處理外)可減弱苯磺隆對(duì)土壤蛋白酶的抑制作用。

農(nóng)藥對(duì)土壤酶活性的影響與施用的土壤類(lèi)型、土壤環(huán)境、氣候條件、農(nóng)藥結(jié)構(gòu)、農(nóng)藥用量及施用時(shí)間、研究方法以及取樣時(shí)間等諸多因素有關(guān)［7］。土壤脲酶能促進(jìn)土壤尿素分子中酰胺碳氮鍵的水解，生成的氨是植物氮素營(yíng)養(yǎng)來(lái)源之一，在氮肥利用和土壤氮素代謝方面有重要的意義［8］。農(nóng)藥對(duì)土壤脲酶的影響已有許多報(bào)道［9-11］。本研究表明，苯磺隆對(duì)脲酶活性為先抑制后激活，隨著苯磺隆濃度的增加抑制和激活作用均增強(qiáng)。說(shuō)明抑制作用是一種暫時(shí)現(xiàn)象，微生物能很快適應(yīng)外來(lái)有機(jī)物的干擾，并利用苯磺隆作為碳源，使酶活性增強(qiáng)。配施尿素、多效唑能夠緩解對(duì)脲酶的抑制作用。這是因?yàn)楸交锹〖捌浣到猱a(chǎn)物與尿素、多效唑分子間形成范德華力和氫鍵，降低了苯磺隆對(duì)土壤脲酶的毒性，且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，為微生物提供了較多碳源和能源，從而激活了脲酶活性。

土壤磷酸酶是能促進(jìn)有機(jī)磷酯或無(wú)機(jī)磷酸鹽轉(zhuǎn)化為植物可利用的無(wú)機(jī)磷酸，可為植物生長(zhǎng)提供有效磷素。李兆君等［12］的研究結(jié)果表明，甲磺隆結(jié)合殘留對(duì)土壤酸性磷酸酶和過(guò)氧化氫酶具有明顯的抑制作用。馬愛(ài)軍等［13］報(bào)道，毒死蜱與乙草胺單一污染和復(fù)合污染對(duì)酸性磷酸單酯酶以及堿性磷酸單酯酶的影響表現(xiàn)為先激活后抑制的效應(yīng)。本研究表明，低濃度苯磺隆對(duì)堿性磷酸酶的影響表現(xiàn)為先激活后抑制再激活的效應(yīng)。這是由于微生物能夠利用苯磺隆作為碳源和能源刺激自身的生長(zhǎng)，從而使堿性磷酸酶活性被激活;但隨著苯磺隆的降解，可利用的碳源和能源減少，堿性磷酸酶活性暫時(shí)降低，隨著小麥的生長(zhǎng)，根際環(huán)境的變化又有利于酶活性的恢復(fù)或增強(qiáng)。配施多效唑、尿素，堿性磷酸酶活性降低，說(shuō)明低濃度苯磺隆與多效唑表現(xiàn)為協(xié)同作用，與尿素以及尿素+多效唑表現(xiàn)為拮抗作用。高濃度苯磺隆配施多效唑、尿素對(duì)堿性磷酸酶仍然呈抑制作用，這是由于苯磺隆等有機(jī)污染物改變了土壤酶的構(gòu)象等。

土壤蛋白酶是氮素轉(zhuǎn)化的重要酶類(lèi)，能水解各種蛋白質(zhì)和肽類(lèi)等化合物為氨基酸，因此，土壤蛋白酶的活性與土壤氮素營(yíng)養(yǎng)的轉(zhuǎn)化狀況存在極重要的關(guān)系［14］。滕春紅等［10］研究氯嘧磺隆對(duì)蛋白酶的影響結(jié)果表明，低濃度氯嘧磺隆對(duì)蛋白酶有輕微的激活作用，而高濃度氯嘧磺隆對(duì)蛋白酶有抑制作用。本研究表明，低濃度苯磺隆最初3d刺激了酶活性，之后對(duì)酶活性呈抑制作用;高濃度苯磺隆在處理后的第14天表現(xiàn)為抑制作用，第28～60天表現(xiàn)為激活作用。這是因?yàn)榈蜐舛缺交锹〈碳ち宋⑸锘钚裕邼舛缺交锹?duì)微生物有不良影響。處理初期，由于苯磺隆分子中的磺酰脲橋被蛋白酶水解，使酶分子的活性部位減少，從而抑制了底物與酶分子結(jié)合，進(jìn)而降低了酶活性，之后，有機(jī)物分解增加了碳源和氮源，從而提高了微生物的活性。從酶活性平均增加現(xiàn)象可見(jiàn)，配施多效唑、尿素減弱了苯磺隆對(duì)土壤蛋白酶的抑制作用，但B1N1X1處理對(duì)酶活性的抑制作用增強(qiáng)，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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