顧麗娟，楊大龍，冷柏榕，嚴(yán)相平*

1南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，南京 210029；2南京工業(yè)大學(xué)江蘇省藥物研究所，南京 210009

五維牛磺酸口服液是多種維生素的復(fù)合制劑，主要成分有水溶性維生素B1、B2、B6、煙酰胺和脂溶性維生素D2、?；撬幔饕糜诰S生素B族缺乏所致疾病的輔助治療。4種水溶性維生素作為主要成分應(yīng)加以定量控制，而我國(guó)現(xiàn)行的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[1]以液相色譜法僅對(duì)維生素B1、B6、煙酰胺含量進(jìn)行測(cè)定。該標(biāo)準(zhǔn)采用流動(dòng)相為0.9%三乙胺溶液-0.5%磷酸乙腈溶液（400：1），流動(dòng)相中水相比例過(guò)高，這對(duì)于碳十八柱壽命不利，且不易重現(xiàn)。盡管有文獻(xiàn)報(bào)道[2-4]采用HPLC法同時(shí)測(cè)定上述4種維生素，然而本品作為營(yíng)養(yǎng)藥，在處方中含有尼泊金乙酯做防腐劑，用文獻(xiàn)報(bào)道條件試驗(yàn)時(shí)，防腐劑出峰時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（約1.5h），無(wú)法用于本品含量測(cè)定。另有部分文獻(xiàn)采用梯度洗脫，操作繁瑣。本文建立了一個(gè)新的色譜條件，同時(shí)測(cè)定五維?；撬峥诜褐械纳鲜?中水溶性維生素的含量。

1 儀器和試藥

ALLTECH 626高效液相色譜儀。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：C18柱(4.6 mm×25 cm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.01 mol·L-1庚烷磺酸鈉溶液 （含0.1%冰醋酸）（50： 50）；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：273 nm；進(jìn)樣量：20 μL。理論板數(shù)按維生素B1峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 溶液配制

對(duì)照品溶液：精密稱取維生素B1對(duì)照品約16 mg、煙酰胺對(duì)照品約9.6 mg，置同一100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻（溶液A）。精密稱取維生素B6對(duì)照品約12.8 mg置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻（溶液B）。精密稱取維生素B2對(duì)照品約10.4 mg置100 mL量瓶中，加冰醋酸1 mL與水75 mL，加熱溶解后，放冷，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻（溶液C）。精密量取溶液A 10 mL，溶液B、C各5 mL置同一100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度。

供試品溶液：精密吸取本品2 mL，置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度。

2.3 線性試驗(yàn)

圖1 HPLC色譜圖

精密量取“2.2”項(xiàng)下溶液A10mL，溶液B、C各5 mL，置同一50mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。精密吸取此溶液4、4.5、5、5.5、6、6.5、7mL， 置10mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。得系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。進(jìn)樣測(cè)定，以相應(yīng)濃度C為橫坐標(biāo)，以各組分峰面積A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得線性方程分別為：VB1，A=-9.335×103+2.197×104C， r=0.9996； VB2，A=4.954×103+6.461×104C， r=0.9998； VB6，A=1.103×103+1.229×104C，r=0.9998； 煙酰胺，A=4.123×103+1.268×104C， r=0.9997。結(jié)果表明，4個(gè)組分的線性范圍分別為12.57～21.99、2.07～3.63、2.52～4.40、2.52～4.40 μg·mL-1。

2.4 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性與中間精密度試驗(yàn)

取樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算得維生素 B1、B2、B6和煙酰胺這 4個(gè)成分峰面積RSD分別為1.05%、1.94%、0.93%和0.74%。

取對(duì)照品溶液，分別于 0、2、4、6、8 h進(jìn)樣，記錄峰面積，考察溶液放置穩(wěn)定性，結(jié)果表明溶液至少在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

取同一批號(hào)的本品（批號(hào)080621），共6份，照“樣品測(cè)定”法項(xiàng)下操作，測(cè)定每份樣品的含量，計(jì)算得4個(gè)成分的RSD分別為0.48%、0.89%、0.67%和1.18%。

取同一批號(hào)本品（批號(hào)0809261），分別由二位實(shí)驗(yàn)者在不同的時(shí)間內(nèi)，分別測(cè)定含量。計(jì)算得中間精密度RSD分別為0.82%、0.77%、0.44%和0.36%。

2.5 回收率試驗(yàn)

按處方工藝，分別以處方量的80%、100%、140%的濃度比例，精密稱取各原料、配制低中高濃度的模擬樣品1000 mL。按照“樣品測(cè)定”項(xiàng)下的方法測(cè)定含量。計(jì)算得平均回收率分別為99.8%、99.7%、99.4%和99.4%，RSD(n=9)分別為0.76%、0.92%、0.28%、0.49%。

2.6 樣品測(cè)定

取3批供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

3 討 論

文獻(xiàn)報(bào)道的流動(dòng)相中均含有庚烷磺酸鈉、己烷磺酸鈉等離子對(duì)試劑，可見(jiàn)離子對(duì)試劑的使用對(duì)于分離測(cè)定上述四種維生素是有意義的。具體到本品，由于處方中以尼泊金乙酯為防腐劑。當(dāng)有機(jī)相的比例較低時(shí)，保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。而幾種維生素的極性都較大，有機(jī)相增加時(shí)，出峰太快，彼此間無(wú)法分離。而離子對(duì)試劑的引入能夠有效解決這一矛盾：尼泊金乙酯不具備與離子對(duì)試劑結(jié)合的基團(tuán)，其色譜行為主要與有機(jī)相的比例密切相關(guān)；而幾種維生素都具堿性氮原子，能夠與離子對(duì)試劑結(jié)合形成離子對(duì)，使得其疏水性增強(qiáng)，從而色譜保留增強(qiáng)，并得以彼此分離。通過(guò)調(diào)整離子對(duì)試劑的種類(lèi)、用量、有機(jī)相的比例，達(dá)到了如下目的：四種主成分保留時(shí)間適當(dāng)，分離良好，且尼泊金乙酯出峰時(shí)間不過(guò)長(zhǎng)。

表1 含量測(cè)定結(jié)果（%）

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).WS-10001-(HD-1442)-2003.五維?；撬峥诜篬S].

[2] 劉曉琳，武 谷，鐘淮濱.HPLC法測(cè)定復(fù)合維生素B溶液中維生素B1、維生素B2、維生素B6和煙酰胺的含量[J]. 中國(guó)藥事，2003，17(4):241-2.

[3] 陸幗蓉，王桂珍.RP-HPLC法測(cè)定復(fù)合維生素B片中維生素B1、B2、B6和煙酰胺的含量[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，26(3)：177-9.

[4] 王學(xué)艷，張伯穎.復(fù)合維生素B注射液中四種水溶性維生素的離子對(duì)-HPLC測(cè)定[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2007，38（5）：378-80.