李立芹，魯黎明

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，四川 雅安 625014）

科學(xué)研究表明，基因的選擇性差異表達決定植物的生長、發(fā)育、衰老、死亡、對逆境的適應(yīng)等生理過程。分離差異表達基因?qū)τ诹私夂徒沂局参矬w的生長、發(fā)育規(guī)律，進而有針對性地對生物性狀進行改良具有重要意義。近年來隨著 PCR技術(shù)的興起，出現(xiàn)了許多基于PCR的分離差別表達基因的新方法。1992年Liang等[1]提出mRNA差異顯示技術(shù)（mRNA differential display reverse transcription PCR或稱 DDRT-PCR），1994年Huband等[2]提出代表性差示分析技術(shù)（representational difference analysis或RDA），1996年Diatchenco等[3-4]提出抑制性差減雜交技術(shù)（suppression subtractive hybridization，SSH），l998年Kang等[5]提出交互扣除 RNA差別顯示技術(shù)（reciprocal subtraction differential RNA display或RSDD）等等。近年來，在上述眾多研究基因差異表達的方法中，SSH技術(shù)由于速度快、假陽性率低、靈敏度高等優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于植物學(xué)研究的各個領(lǐng)域[6]。煙草是我國重要的經(jīng)濟作物之一，面積和總產(chǎn)量都居世界第一。與此同時，它作為模式植物，在植物學(xué)的研究領(lǐng)域具有重要的科研意義，尤其是在遺傳、繁育、生理、生化和轉(zhuǎn)基因等研究領(lǐng)域。筆者就SSH技術(shù)的基本原理、主要方法及該技術(shù)的優(yōu)缺點等進行了介紹，并綜述了其在煙草研究領(lǐng)域中的應(yīng)用進展。

1 抑制性消減雜交技術(shù)的主要原理和方法

1.1 cDNA的合成

提取2種不同材料如正常情況和經(jīng)過處理的樣RNA，然后從中分離出mRNA，分別作為參照樣本（driver）和檢測樣本（tester）。接著在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下將這2個樣品的mRNA分別轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2 cDNA的酶切

將檢測樣本（tester）和參照樣本（driver）的cDNA分別以RcaI或HaeIII等識別四堿基的限制性內(nèi)切酶切割，這些酶在44=256 bp處就有一切點，因此cDNA經(jīng)酶切后可產(chǎn)生許多個小片段，且最長片段約為600 bp。

1.3 接頭連接

將檢測樣本經(jīng)酶切后的cDNA片段均等分為2份，分別連上接頭 1（Adapter-1）和接頭 2（Adapter-2），接頭是一段雙鏈DNA片段，由一長鏈（約40余個核苷酸）和一短鏈（約10個核苷酸）組成。值得注意的是2個接頭末端設(shè)計為缺少磷酸基團，以便只有DNA片段3’端與cDNA的5’端共價結(jié)合。此外接頭1和2的外側(cè)序列依次與第1次PCR引物相同；內(nèi)側(cè)序列分別與第2次PCR引物的兩個相同。同時接頭上還含有 T7啟動子系列和多個限制性內(nèi)切酶識別位點，為后續(xù)差異片段的測序和相關(guān)載體的構(gòu)建提供了方便。

1.4 扣除雜交

SSH技術(shù)中第1次扣除雜交時，把過量的參照樣本（driver）加入到連有兩個接頭的 cDNA中進行變性和退火雜交，則檢測樣本和參照樣本中系列相同的片段形成雙鏈片段而留下各自有差別表達的片段。經(jīng)過第1次扣除雜交，檢測樣本（tester）中的 cDNA單鏈（a）均等化了，即表達有差別的cDNA相對含量大體相等。這是二級雜交動力學(xué)原理的應(yīng)用，即豐度高的單鏈cDNA退火時產(chǎn)生同源雜交雙鏈 cDNA（b）的速度要快于豐度低的單鏈cDNA。第2次扣除雜交時，在第1次雜交后的產(chǎn)物中加入新制備變性的參照樣本（driver），再次退火雜交。因此雜交后形成4種類型的DNA片段，即 Tester-cDNA 單鏈（a）、同源雜交雙鏈 cDNA（b）、相同的片段形成了異源雙鏈分子（c）、帶有兩種接頭的雜交分子（e）。最后一種就是在檢測樣本（tester）和參照樣本（driver）樣本之間所存在的那些有差別表達的片段，能在以后的PCR中有效地以指數(shù)形成擴增。這樣達到富集目標(biāo)cDNA的目的。

1.5 PCR擴增

在PCR反應(yīng)中，只有（e）類cDNA片段能被大量擴增。然而其他 3種，如 a、d類無引物結(jié)合點，不能擴增；（b）類兩端均為同一接頭，鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火。因此會在鏈內(nèi)形成發(fā)夾或鍋柄結(jié)構(gòu)，故不能被擴增。第1次PCR擴增，依據(jù)PCR抑制效應(yīng)的原理，只有兩端分別為接頭1和接頭2的差異片段才能以指數(shù)形式擴增；第2次PCR主要是特異性擴增，并可用于后續(xù)研究工作。

1.6 轉(zhuǎn)化、篩選與鑒定

第2次PCR所得的差別表達cDNA片段可以利用接頭上已有的酶切位點，連接到適當(dāng)載體中去轉(zhuǎn)化大腸桿菌。然后經(jīng) X–gal-IPTG顯色反應(yīng)（即把大腸桿菌涂布在含X–gal和IPTG的培養(yǎng)基平板上，根據(jù)克隆的顏色來判斷陽性克?。?，初步確定出陽性克隆。最后對插入差異片段進行測序和序列比對等工作，從而得到差異片段的相關(guān)信息。抑制性消減雜交（SSH）技術(shù)的主要步驟如圖1所示。

2 抑制性消減雜交技術(shù)的主要優(yōu)缺點

SSH技術(shù)與其他技術(shù)相比主要的優(yōu)點如下：（1）篩選周期短、效率高，一輪SSH過程僅需3～4 d，且一次反應(yīng)可同時分離幾十或上百個差異表達的基因片段。（2）假陽性率低，由于2次扣除雜交和2次PCR作用，SSH技術(shù)陽性率高達94%[7]。（3）靈敏程度高，SSH用RsaI或HaeIII酶切后產(chǎn)生許多cDNA片段，保證差別DNA的檢出率；同時，由于該技術(shù)可以富集差別DNA達1000～5000倍左右[8]，從而保證了低豐度 mRNA能被檢出。(4)操作簡便易行，一般分子生物學(xué)實驗室即可完成。

SSH技術(shù)與其他技術(shù)相比主要的缺點如下：

（1）實驗中所需的mRNA量較大（一般微克級），因而某些特殊樣本的mRNA不易獲得。此外，對植物組織而言，應(yīng)盡量選擇幼嫩的組織作為研究對象，因為一些老的植物組織不易分離出高質(zhì)量的mRNA，影響后面的實驗操作。

圖1 抑制性消減雜交 ( SSH) 步驟示意圖（Diachenko et al,1996, 黃鑫等, 2006）Fig.1 The principle and progress of suppression subtractive hybridization (SSH) (Diachenko et al, 1996, Huang Xin et al,2006)

（2）SSH中的2次扣除雜交Driver-cDNA均過量，故可能掩蓋Tester-cDNA中某些表達有豐度差別的cDNA，難以發(fā)現(xiàn)某些有差別表達的基因，為后續(xù)的研究工作增加難度。

（3）SSH技術(shù)不能同時對數(shù)個材料之間進行比較，一次只能比較2個樣品；而且所研究的材料的差異不宜太大，否則假陽性率升高。

3 抑制性消減雜交技術(shù)在煙草研究中的應(yīng)用

3.1 在發(fā)育研究中的應(yīng)用

煙草烤煙品種K326在我國已推廣20余年，目前仍是我國推廣種植面積最大的品種，表明該品種煙葉內(nèi)在質(zhì)量優(yōu)異。為了分析該品種參與葉片發(fā)育的基因，潘建菁等[9]利用SSH技術(shù)，構(gòu)建其莖葉抑制性消減cDNA文庫。實驗結(jié)果表明，插入基因片段長度在200～1000 bp之間，符合構(gòu)建文庫標(biāo)準(zhǔn)。但并未對差異片段進行分析和報道。

煙草突變體 T-cdf是經(jīng)過航天誘變獲得的，形態(tài)特征是葉片表面起皺尤其是次級葉脈之間突起和延遲開花的特性[10]。經(jīng)過掃描電鏡分析，煙草突變體 T-cdf的葉片形態(tài)特征是由于葉片表面細胞的生長失衡所致。為了從分子水平上揭示該突變體煙葉生長發(fā)育規(guī)律，蔡劉體等[11]以煙草突變體 T-cdf和煙草品種K346葉片分別作為Tester和Driver材料，構(gòu)建了抑制性消減cDNA文庫，經(jīng)過陽性克隆的鑒定和序列分析共獲得 62個表達序列標(biāo)簽（ESTs，已登錄GenBank數(shù)據(jù)庫），按照功能可劃分為7類。其中與煙草光合作用相關(guān)的ESTs有9個，這些基因的表達都是上調(diào)的，例如葉綠體中兩個a/b結(jié)合蛋白（EB102894；E B102895）、光合系統(tǒng)I反應(yīng)中心亞單位XpsaK（EB041775）和光合系統(tǒng)II中一個分子量是23 kD多肽鏈（EC391385）。煙草突變體 T-cdf葉片上表面隆起的皺葉形態(tài)特征是由于葉片上表皮細胞分裂速率比野生型葉片上表皮快[11]，因此這些上調(diào)表達的基因可能參與這一過程。此外水孔蛋白（EB041772）和類水水孔蛋白（EC391403）在煙草突變體T-cdf葉片中表達是上調(diào)的。關(guān)于水孔蛋白的功能，Uehlei等[12]報道在煙草葉片中人為過量表達NtQP1，一種水孔蛋白能加強細胞膜對二氧化碳和水的滲透性，促進葉片的生長和發(fā)育。由此推測這2個基因的表達上調(diào)也可能是引起突變體葉片上表面隆起的原因之一，當(dāng)然仍需要相關(guān)實驗證明。此外還發(fā)現(xiàn)與結(jié)構(gòu)蛋白相關(guān)的ESTs有4個，與抗性防衛(wèi)蛋白相關(guān)的ESTs有5個，與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的ESTs有2個，與代謝功能相關(guān)的ESTs有11個。蔡劉體等[13]進一步的研究工作從以上構(gòu)建的SSH文庫中，篩選到一個表達序列標(biāo)簽P1T10（GenBank Access No.EB102896），結(jié)合末端快速擴增（RACE）方法克隆到這個基因全長的cDNA，通過軟件分析表明該基因編碼一個 110個氨基酸的小分量蛋白（GenBank Access No.ABE03627），它與煙草葉片一個表面抗性蛋白（GenBank Access No.AY705384）具有93%的同源性。表達分析證明，該基因在煙草突變體 T-cdf葉片中的表達量明顯高于對照。

3.2 在抗病研究中的應(yīng)用

水楊酸是一種酚類激素，可調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育，同時還作為內(nèi)生信號參與植物對病原菌的抵御，通過誘導(dǎo)組織產(chǎn)生病程相關(guān)蛋白，當(dāng)植物的一部分受到病原體感染時在其他部分產(chǎn)生抗性。以上抗病反應(yīng)的獲得是由基因表達差異所決定的。董霞等[14]利用消減雜交（SSH）技術(shù)構(gòu)建SA誘導(dǎo)的煙草差異表達文庫，為克隆抗病相關(guān)基因及進一步從分子水平研究SA誘導(dǎo)的抗病反應(yīng)變化規(guī)律奠定基礎(chǔ)。他們的方法是以漂浮育苗法培育的云煙 85煙苗為試驗材料，以0.1 mmol/L SA誘導(dǎo)的煙苗分別在24、48、72 h取樣，混合后提取的RNA為Tester，以清水噴施處理煙苗的 RNA為 Driver；對隨機挑選的 12個陽性克隆進行測序，經(jīng)過序列分析比對后發(fā)現(xiàn)有4條片段與Sar8.2g基因同源性為100%，有2條片段與Sar8.2d 基因同源性為98%和99%。1條與抗性相關(guān)蛋白1a的同源性一致性為100%。此外序列中還有1條與光系統(tǒng)II的促氧蛋白的33 kDa亞基有較高同源性，1條與水通道蛋白基因（aquaporin 1）同源，1條與Ertl3基因有同源性，1條沒有相關(guān)信息，為未知功能的新基因。

煙草霜霉病（Blue Mold）是一種由真菌引起的重要病害。在適合病害發(fā)生發(fā)展的條件下，往往造成毀滅性的破壞。煙草霜霉病菌在世界不同生態(tài)地區(qū)有高度適應(yīng)性和極強的傳播力。麥格隆熄豐煙是一個野生煙草品種，通常作為煙草遺傳育種的模式植物。例如它對黑脛病和霜霉?。≒.parasitica var.nicotianae and Peronospora hyoscyami）有較強的抗性，為了鑒定該品種參與抵抗霜霉病的基因。Hidalgo等[15]應(yīng)用SSH技術(shù)研究不親和性相互作用不同時期轉(zhuǎn)錄本，通過雜交共檢測到182個不同克隆，通過測序和分析，鑒定的基因參與植物各種各樣的生理過程。通過Northern Blot 證明其中16個基因在親和性和不親和性的相互作用中具有不同的表達模式。進一步工作從中挑選4個基因進行深入研究，結(jié)果表明它們在不親和的相互作用中快速和大量誘導(dǎo)表達，而在親和的相互作用中沒有觀察到誘導(dǎo)表達。采用基因沉默的方法敲除一個磷脂膜上的轉(zhuǎn)運蛋白和谷氨酸鹽脫羧酶并不影響煙草對霜霉病的抗性，但是敲除 EIL2轉(zhuǎn)錄因子和谷胱甘肽合成酶基因后使煙草減弱對霜霉病的抗性，因此有希望通過在煙草中過量表達這2個基因來培育霜霉病的品種。

煙草黑脛病是世界煙草生產(chǎn)中最主要的病害之一，這種病在高溫高濕的條件下發(fā)展迅速。特點是發(fā)病率高，分布范圍廣，造成的經(jīng)濟損失巨大。這種病原菌侵害植株發(fā)育各個時期的根、莖和葉等部位，導(dǎo)致根、莖壞死、植株發(fā)育遲緩，嚴重植株死亡。為了鑒定麥格隆熄豐煙參與抵抗黑脛病的基因，Chacon等[16]應(yīng)用同Hidalgo等同樣的方法構(gòu)建SSH文庫，通過雜交共篩選到48個基因克隆。經(jīng)過分析后將它們分成6個組，分別參與防衛(wèi)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)運、代謝、能量、蛋白合成等生理過程。后續(xù)的實驗第一次證明 hrs203J和一個鋅指蛋白在非親和性的相互作用中有很強的誘導(dǎo)表達。同時發(fā)現(xiàn)這些基因并不受親和性相互作用的誘導(dǎo)。這些說明它們對煙草抗病性是有貢獻的，可能是參與抗病的靶基因。要明確它們的功能還需要進一步實驗。

3.3 在逆境研究中的應(yīng)用

硫是煙草必需的營養(yǎng)元素之一，煙株干物質(zhì)的含硫量一般在0.2%～0.7%之間。煙草缺硫后癥狀：新葉呈均一的淺黃綠色，而老葉仍保持綠色，隨后發(fā)展至整株黃化，葉片小，節(jié)間短。為了研究煙草適應(yīng)硫脅迫的分子機制，Wawrzynska等[17]利用SSH技術(shù)鑒定到38個響應(yīng)短期硫脅迫的基因，其中22個基因參與正向調(diào)節(jié)，16個基因參與負向調(diào)節(jié)。材料來源于 4個部位（幼嫩、成熟葉片、莖和根），這4個部位會表現(xiàn)出不同的硫缺乏癥狀。有趣的是在植物的不同部位一些基因表現(xiàn)出不同的表達方式。數(shù)據(jù)庫分析表明所鑒定到的基因可分成9組，每組都有表達上調(diào)和下調(diào)的基因。這9組基因參與病原菌抗性、細胞壁合成基因、蛋白降解、光合作用、碳代謝、硫代謝、核糖體組裝等過程。值得注意的是檢測到4個參與硫代謝的基因表達都是上調(diào)的，這4個基因分別是磷脂酸磷酸半胱氨酸合成酶、亞硫酸鹽還原酶、硫酸鹽轉(zhuǎn)運體和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶。推測這4個基因與煙草的硫代謝密切相關(guān)。

在離體條件下，當(dāng)高等植物的小孢子遭受各種各樣的逆境脅迫時，它們能夠調(diào)整發(fā)育的方向以便形成單倍體的植株。Hosp等[18]采用SSH技術(shù)來研究這種發(fā)育過程的轉(zhuǎn)變。在逆境處理后的配子中通過反向Northern blot雜交的方法鑒定到90個上調(diào)的序列。經(jīng)過比對、分析后可把這些序列分成5組，它們分別是參與代謝、染色體重塑、信號、轉(zhuǎn)錄和翻譯等過程。其中這些序列中有一半功能未知。

3.4 在遺傳育種研究中的應(yīng)用

從育種角度考慮，雖然單倍體本身并無直接利用價值，但通過染色體加倍處理可獲得雙單倍體。從選擇的效率來看，雙單倍體比一般的二倍體優(yōu)越，它可以保證基因型是純合的，所需性狀不會因后代分離而丟失。在遺傳學(xué)研究中，單倍體和雙單倍體還可以作為基因突變、基因與環(huán)境互作以及數(shù)量遺傳等研究的基礎(chǔ)材料，可以找到在二倍體中很難發(fā)現(xiàn)的稀有基因。Shary等[19]利用SSH技術(shù)以雙單倍體分化的愈傷組織為 Tester，以增殖的愈傷組織為Driver，檢測在不同分化時期表達的基因。共篩選到 41個不同的基因克隆，這些基因在不同分化組織中表達是上調(diào)的。其中21個基因未見報道，可能是新基因，還有 20個與數(shù)據(jù)庫中的其他基因具有高度的同源性。這20個基因可分為7組，有4個基因與光合相關(guān)，有2個基因參與轉(zhuǎn)錄后修飾過程，參與蛋白合成的有2個基因，參與蛋白運輸?shù)挠?個基因，還有1個結(jié)構(gòu)基因，2個與代謝相關(guān)的基因和7個未分類的基因。

煙草的育種目標(biāo)主要集中在高產(chǎn)、高抗、優(yōu)質(zhì)3個方面。實現(xiàn)育種目標(biāo)有多種途徑，雜種優(yōu)勢的利用是其中之一。與常規(guī)育種方法比較，利用雜種優(yōu)勢在實現(xiàn)育種目標(biāo)上需時短、見效快，可以盡快解決我國目前煙草生產(chǎn)上對優(yōu)質(zhì)高抗品種的迫切需要。雜種致死對于雜交育種是一個很重要的問題，但是關(guān)于這個問題的分子機制并不清楚。Masuda等[20]的研究集中在鑒定雜種煙草細胞（野生種煙草×煙草）致死過程中的基因。首先提取雜種致死細胞中的 RNA和能夠存活雜種細胞中的RNA，取材的時間包括4個，即在誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后、在開始發(fā)生程序性死亡和發(fā)生后期。通過SSH分析和斑點印跡法，在138個分離到克隆發(fā)現(xiàn)99個基因被鑒定是雜種致死的基因。實時定量PCR分析表明在致死的雜種細胞中有10個克隆是特異性表達。發(fā)現(xiàn)的雜種致死基因參與病菌抗性、乙烯誘導(dǎo)的反應(yīng)、磷酸化、泛素化、茉莉酸相關(guān)反應(yīng)、鈣信號和自交不親和等過程。這些數(shù)據(jù)表明，至少在某種程度上雜種致死的機制與那些預(yù)測參與雜種致死的基因是相關(guān)的。

4 展 望

雖然SSH技術(shù)問世至今只有10多年的時間，卻在生物學(xué)各個研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。特別是在差異基因的表達、鑒定和克隆中發(fā)揮巨大的作用。高等生物大約 10萬個基因，在正常情況下，真核生物基因組中只有15%的基因得以表達，因此大力挖掘植物中有價值的新基因是今后科研的主要方向。今后隨著SSH技術(shù)的不斷發(fā)展、改進以及結(jié)合其他技術(shù)，如cDNA微陣列及高密度點陣膜等可以快速對差減產(chǎn)物進行分析，它將日益成為科研工作者手中克隆新基因、研究基因表達和植物生長發(fā)育的有效工具。煙草作為一種重要的經(jīng)濟和科研的模式植物，對我國經(jīng)濟生產(chǎn)和科學(xué)研究起到舉足輕重的作用。因此，采用SSH技術(shù)分離煙草中與品質(zhì)、抗病、抗逆性相關(guān)功能基因及研究煙草基因表達調(diào)控的規(guī)律，具有極其重要的意義，前景十分廣闊。

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