李鳳霞

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101）

功能基因組學(xué)研究中，常常通過(guò)改變基因的表達(dá)水平，然后觀察其生物學(xué)性狀、環(huán)境適應(yīng)性以及生理或代謝途徑等方面的變化來(lái)研究基因相應(yīng)的生物學(xué)功能。這種研究策略包括強(qiáng)制性地沉默或升高特定基因的表達(dá)水平，即功能缺失（loss of function）和功能獲得（gain of function）策略。

1 功能缺失策略

基因功能缺失策略即篩選目的基因功能部分或全部喪失的植株，比較其與野生型植株在表型、生理代謝和基因表達(dá)上的差異，分析該基因的功能。以往功能缺失研究通常是通過(guò)篩選自然突變體來(lái)獲得基因功能部分或全部喪失的植株，但概率很低，現(xiàn)在一般通過(guò)反義RNA（antisense RNA）、共抑制（cosuppression）、人工誘變、RNA干擾（RNA interference, RNAi）來(lái)進(jìn)行基因功能缺失研究。

1.1 反義RNA

反義RNA是指與特定DNA或RNA具有互補(bǔ)序列的小分子RNA，它們通過(guò)特異性的堿基互補(bǔ)方式抑制或封閉相應(yīng)基因的表達(dá)。反義RNA技術(shù)提供了直接有效地人為控制基因表達(dá)的方法，現(xiàn)已成為功能缺失研究中的一項(xiàng)重要技術(shù)[1]，并在煙草功能缺失研究中得到較多的應(yīng)用[2-3]。由于該方法的抑制效率不能達(dá)到理想的功能缺失，因而無(wú)法對(duì)基因功能進(jìn)行大規(guī)模的準(zhǔn)確分析，使得其應(yīng)用受到一定的限制。

1.2 共抑制

共抑制是指正向的基因全長(zhǎng)序列與高活性的組成型啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子融合，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)基因植株中該序列所表達(dá)的RNA抑制了相應(yīng)內(nèi)源基因的表達(dá)。共抑制現(xiàn)象來(lái)源于一些植物轉(zhuǎn)基因事件偶然發(fā)現(xiàn)，最著名的是Napoli等[4]的矮牽?；ㄉ牧紝?shí)驗(yàn)，將花色有關(guān)的查爾酮合成酶基因（CHS）在矮牽牛中過(guò)表達(dá)后，約50%轉(zhuǎn)基因植株的外源CHS與內(nèi)源基因一起發(fā)生沉默，導(dǎo)致花色改變。Matzke等[5]將Hyg OCS轉(zhuǎn)化經(jīng)過(guò)KanNOS基因遺傳轉(zhuǎn)化的煙草中，發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因的基因失活現(xiàn)象。Goring等[6]進(jìn)行了相似的實(shí)驗(yàn)，將nopaline合成酶基因的部分編碼序列轉(zhuǎn)化到已經(jīng)轉(zhuǎn)化了nopaline合成酶基因并能表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草中，該基因的mRNA降到了最低點(diǎn)。

1.3 人工誘變方法

人工誘變獲得突變體是功能缺失研究中不可缺少的一種方法，突變能導(dǎo)致基因功能的喪失或減弱。其中在T-DNA插入突變研究中，根據(jù)目標(biāo)基因序列和插入序列設(shè)計(jì)的特異引物對(duì)這些突變體基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以篩選到任何一個(gè)插入失活的基因。目前在煙草上通過(guò)人工誘變的方式獲得了抗煙草花葉病、不育、溫度依賴(lài)、低煙堿、白化等突變體，并鑒定了部分導(dǎo)致功能缺失的突變基因[7]。由于煙草是異源四倍體植物，煙草中有有一定數(shù)量的基因是多拷貝的，甚至緊密地串聯(lián)在一起，在利用人工誘變方法分析基因功能時(shí)，通常不易得到目標(biāo)基因的純合突變體。

1.4 RNAi

RNAi是指雙鏈RNA分子引起的序列特異性降解靶基因mRNA，從而導(dǎo)致內(nèi)源靶基因沉默的現(xiàn)象。與反義RNA和共抑制技術(shù)相比，RNAi能夠強(qiáng)有力地抑制序列特異的目的基因表達(dá)，抑制效率高，操作簡(jiǎn)便、迅速，耗費(fèi)的精力和財(cái)力較小?，F(xiàn)在，RNAi技術(shù)已經(jīng)成為基因功能缺失研究的常規(guī)手段，并成為當(dāng)前植物生物學(xué)家探索基因功能的一個(gè)有力的工具[8]，在煙草基因缺失研究中也具有良好的應(yīng)用前景[9]，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所通過(guò)GATEWAY方法構(gòu)建煙草抗病基因同源序列的RNAi文庫(kù)，通量遺傳轉(zhuǎn)化后進(jìn)行相應(yīng)基因的功能鑒定。

2 功能獲得策略

新基因的功能獲得策略是指通過(guò)將新基因直接導(dǎo)入到細(xì)胞或生物體中，通過(guò)觀察其細(xì)胞生物特性或特體表型遺傳性狀的變化來(lái)鑒定基因的功能，常用的方法有超表達(dá)（overexpression）、基因誘導(dǎo)表達(dá)（inducible gene expression）和獲得性突變。

2.1 超表達(dá)

超表達(dá)是指目的基因全長(zhǎng)序列與高活性的組成型啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子融合，通過(guò)轉(zhuǎn)化，獲得該基因產(chǎn)物大量積累的植株。該方法已成功鑒定了一批煙草編碼基因、轉(zhuǎn)錄因子的功能[10-11]，但與反義抑制和共抑制類(lèi)似，它也有轉(zhuǎn)基因植株的致死效應(yīng)或強(qiáng)烈的多重效應(yīng)，從表型中鑒定出所需的轉(zhuǎn)基因植株較為困難。

2.2 基因誘導(dǎo)表達(dá)

在轉(zhuǎn)基因的突變體、異源受體植株或組織中，通過(guò)在攜帶外源基因的載體上加上組織特異性啟動(dòng)子或誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子，控制外源基因在特定的時(shí)間或特定的組織器官中表達(dá)，可避免超表達(dá)所帶來(lái)的麻煩。在非誘導(dǎo)條件下，轉(zhuǎn)基因不表達(dá)或表達(dá)但其產(chǎn)物沒(méi)有活性，不會(huì)干擾植物的正常發(fā)育，也不會(huì)導(dǎo)致多重效應(yīng)。一旦給予誘導(dǎo)，基因?qū)⒀杆俦磉_(dá)或其產(chǎn)物迅速被激活，并在一定時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定。利用誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，煙草糖基轉(zhuǎn)移酶基因被誘導(dǎo)表達(dá)，從表型變化鑒定了其功能[12]。

2.3 獲得性突變

功能獲得性突變方法是從本質(zhì)上改變基因作用的一種突變，該方法能使在植物特定組織、細(xì)胞中原來(lái)不表達(dá)的基因得以表達(dá)，或表達(dá)較弱的基因表達(dá)水平升高，使表型更加明顯。常用的功能獲得性突變策略是對(duì)T-DNA進(jìn)行人工修飾，在T-DNA上加入調(diào)控序列，如35S強(qiáng)啟動(dòng)子或其他特異性表達(dá)啟動(dòng)子，插入的T-DNA可能導(dǎo)致插入位點(diǎn)鄰近基因的過(guò)量表達(dá)或表達(dá)的時(shí)空特異性改變，從而有效的鑒定基因功能。

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