張成省，王海濱，李更新，孫慧麗，孔凡玉*，蔣光偉

（1.煙草行業(yè)病蟲害監(jiān)測(cè)與綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部煙草類作物質(zhì)量控制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.山東中煙工業(yè)公司，濟(jì)南 251000；3.山東濰坊煙草公司，山東 濰坊 262200；4.山東濰坊煙草公司青州分公司，山東 青州 262200）

煙葉的自然醇化或人工發(fā)酵是提高煙葉燃吸品質(zhì)和可用性的必要環(huán)節(jié)之一[1]。煙葉醇化貯藏周期長達(dá) 1～2年，期間極易發(fā)生霉變，使煙葉品質(zhì)降低或完全失去使用價(jià)值。2002年我國加入WTO后，儲(chǔ)煙逐漸由片煙替代把煙，儲(chǔ)煙霉變問題更加突出，開始引起人們的重視，相關(guān)研究報(bào)道逐漸增多。李魁等[2]對(duì)我國煙葉和卷煙表面真菌進(jìn)行了分離鑒定，對(duì)正常和霉變煙草真菌種類和數(shù)量進(jìn)行了分析。趙文姬[3]分析了部分云南儲(chǔ)煙霉變樣品，明確了引起云南煙葉霉變的主要類群為曲霉和青霉。黃福新等[4]調(diào)查了廣西貯藏?zé)熑~霉變發(fā)生狀況，認(rèn)為貯藏?zé)熑~霉變及霉變程度與煙倉的設(shè)施條件和倉貯管理密切相關(guān)。上述研究初步明確了誘致煙葉霉變的微生物類群及其生物學(xué)特性，為揭示煙葉霉變規(guī)律提供了微生物學(xué)研究基礎(chǔ)。但對(duì)片煙霉變發(fā)生條件、影響因素缺乏系統(tǒng)研究，在片煙倉儲(chǔ)管理中缺乏可供參考的片煙防霉相關(guān)技術(shù)參數(shù)或指標(biāo)。本研究通過單因素實(shí)驗(yàn)與正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法，研究了環(huán)境溫度、環(huán)境濕度和片煙含水率等因子對(duì)片煙霉變的影響，目的在于揭示片煙霉變規(guī)律，明確片煙霉變的關(guān)鍵因子。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試片煙樣品：產(chǎn)地為山東諸城，等級(jí)分別為X2L、C3F、B2F，由山東中煙工業(yè)公司技術(shù)中心提供。

化學(xué)試劑：碳酸鉀、亞硝酸鈉、氯酸鈉、硫酸銨、碳酸鈉、硫酸鋅、硫酸鈣均為化學(xué)純，由青島碧海商貿(mào)公司提供。

主要儀器：5.0 L干燥器，JD200—3型電子天平，SWCJ—lF型超凈工作臺(tái)，S.C.101鼓風(fēng)電熱干燥箱，人工氣候箱。

1.2 環(huán)境溫度、濕度條件模擬

參考 Abellana等[5]和 Abramson等[6]方法模擬環(huán)境溫度、濕度等條件對(duì)煙草霉變的影響。

1.3 片煙霉變影響條件的單因素分析

1.3.1 環(huán)境溫度對(duì)片煙霉變的影響 將片煙的含水率調(diào)至28%，用干凈的塑料袋密封好，分別置于4、15、20、25、30、35 ℃下，每袋500 g片煙，重復(fù)3次。觀察、記錄生霉?jié)摲冢ㄓ稍囼?yàn)開始至肉眼首次觀察到霉變的時(shí)間）和片煙霉變程度。

1.3.2 環(huán)境濕度對(duì)片煙霉變的影響 準(zhǔn)確稱量5.0 g片煙，放入不加蓋的培養(yǎng)皿中，分別置于5.0 L不同環(huán)境濕度（65%、70%、75%、80%、85%、90%、94%）的干燥器中，每處理3次重復(fù)，分別于25 ℃培養(yǎng)，連續(xù)觀察60 d，之后置室溫下繼續(xù)觀察，記錄生霉?jié)摲诤推瑹熋棺兂潭取?/p>

1.3.3 含水率對(duì)片煙霉變的影響 將片煙的含水率分別調(diào)至 12.98%、15.16%、19.08%、22.10%、25.30%、34.32%后，用干凈的塑料袋密封好，每袋1 kg，重復(fù)3次，置25 ℃培養(yǎng)，連續(xù)觀察60 d，之后置室溫下繼續(xù)觀察，記錄生霉?jié)摲诤推瑹熋棺兂潭取?/p>

1.4 片煙霉變影響因素的正交試驗(yàn)

根據(jù)對(duì)片煙霉變發(fā)生條件單因素實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果，選取溫度20、25、30 ℃，環(huán)境濕度70%、75%、80%以及片煙初始含水率12.98%、15.16%、19.08%，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，進(jìn)一步篩選片煙霉變發(fā)生的臨界指標(biāo)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。每3 d觀察1次，連續(xù)觀察60 d，記錄生霉?jié)摲诤兔棺兂潭取?/p>

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table1 Factors and levels of orthogonal test

1.5 片煙霉變程度劃分

目前對(duì)片煙霉變程度劃分尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，本研究所用霉變程度調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)如下：無霉變（未發(fā)現(xiàn)有霉變現(xiàn)象）；始霉（霉點(diǎn)分布稀疏，霉菌分布最大量不超過整個(gè)表面積的5%）；輕度霉變（霉菌分布占整個(gè)表面積的5%～20%）；中度霉變（霉菌分布占整個(gè)表面積的20%～50%）；重度霉變（霉菌分布占整個(gè)表面積的 50%以上，或整個(gè)表面布滿菌絲）。

2 結(jié) 果

2.1 環(huán)境溫度

溫度對(duì)片煙霉變影響的測(cè)定結(jié)果如表 2。從中可以看出，在4～35 ℃范圍內(nèi)，含水率28%的片煙均可發(fā)生霉變。在4 ℃低溫冰箱下存放45 d，片煙即開始霉變，隨著溫度的升高，片煙霉變的速度逐漸加快，25 ℃時(shí)7 d即可發(fā)霉。30 ℃和35 ℃時(shí)3 d即可見霉變發(fā)生，說明片煙在 25～35 ℃較易發(fā)生霉變，以30～35 ℃最為適宜。

表2 不同溫度條件下片煙各霉變程度始發(fā)時(shí)間Table2 Mildewing start days of tobacco strip under various temperatures

2.2 環(huán)境濕度

25 ℃條件下，不同環(huán)境濕度對(duì)片煙霉變的影響測(cè)定結(jié)果如表3所示。片煙的霉變發(fā)生、發(fā)展與空氣相對(duì)濕度密切相關(guān)?？諝庀鄬?duì)濕度越大，霉變發(fā)生越早，霉變發(fā)展越快?？諝鉁囟?25 ℃時(shí)，當(dāng)相對(duì)濕度≥85%，片煙霉變非?？欤瑑H存放1周便可發(fā)霉。當(dāng)空氣濕度為80%時(shí)，片煙霉變時(shí)間相對(duì)長一些，需要19 d。當(dāng)空氣相對(duì)濕度為75%時(shí)，片煙也可以發(fā)生霉變，但時(shí)間較長，且60 d內(nèi)霉變程度較輕。在空氣濕度≤70%時(shí)，片煙未見有霉變現(xiàn)象。

此外，60 d實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將各處理置自然條件下繼續(xù)進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)300 d內(nèi)，空氣濕度70%和65%處理片煙仍未見有霉變現(xiàn)象，75%空氣濕度處理片煙有輕度霉變發(fā)生，80%空氣濕度處理片煙有中度霉變發(fā)生，85%以上空氣濕度處理片煙均重度霉變發(fā)生，其發(fā)霉嚴(yán)重度為 85%空氣濕度處理＜90%空氣濕度處理＜94%空氣濕度處理。

表3 不同濕度條件下片煙各霉變程度始發(fā)時(shí)間Table3 Effects of humidity on mildewing of tobacco strips

2.3 片煙含水率

片煙霉變的發(fā)生與發(fā)展與片煙含水率密切相關(guān)。如表4所示，片煙含水率越高，霉變發(fā)生越早，霉變發(fā)展越快。在25 ℃下，當(dāng)片煙含水率為34%時(shí)，片煙僅存放3 d便發(fā)霉，1 kg的片煙10 d就完全霉變，當(dāng)片煙含水率13.60%，300 d內(nèi)未觀察到霉變發(fā)生，片煙含水率為15%時(shí)，51 d有輕度霉變發(fā)生，說明片煙發(fā)生霉變臨界含水率在 13.5%～15.0%。

表4 不同含水率片煙各霉變程度始發(fā)時(shí)間Table4 Effects of water content on mildewing of tobacco strips

2.4 正交試驗(yàn)

溫度、濕度和片煙含水率對(duì)片煙霉變影響的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行期間，處理1和處理4未觀察到霉變發(fā)生，說明在環(huán)境溫度空氣相對(duì)濕度70%，片煙含水率15%以下，溫度在20～30 ℃范圍內(nèi)，片煙不容易發(fā)生霉變。處理2和處理8發(fā)生輕度霉變，且生霉?jié)摲谳^長，分別于45 d和51 d有霉變發(fā)生，且霉變程度相對(duì)較輕，說明片煙在空氣相對(duì)濕度75%，片煙初始含水率15%，20～30 ℃范圍內(nèi)可發(fā)生輕度—中度霉變。處理7（溫度30 ℃，相對(duì)濕度70%，初始含水率19%）出現(xiàn)霉變最早（13 d），但霉變程度發(fā)展到中度霉變后，即穩(wěn)定下來，不再進(jìn)一步擴(kuò)展。處理 6、9、5、3生霉?jié)摲谝来巫冮L，24 d內(nèi)，均可見霉變發(fā)生，且霉變發(fā)展速度較快，霉變程度較重，說明空氣相對(duì)濕度為80%以上，或空氣相對(duì)濕度75%、片煙初始含水率高于19%時(shí)，片煙極易發(fā)生霉變。

表5 片煙霉變條件正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table5 Design and analysis result of orthogonal test

3 討 論

煙葉霉變與霉菌污染、環(huán)境條件以及煙葉基質(zhì)特性密切相關(guān)[7]。煙葉在調(diào)制、分級(jí)、收購、運(yùn)輸儲(chǔ)存等過程中都有可能受到霉菌的污染而帶有大量霉菌。尤其是不成熟的上部煙、青黃煙和其他帶有雜質(zhì)的低次煙，往往帶有較多的霉菌，比較容易自然霉變[8]。霉菌污染煙葉后，能否導(dǎo)致煙葉的霉變，以及霉變的程度和性質(zhì)如何，主要受煙葉本身的性質(zhì)及環(huán)境條件等因素的影響。本研究重點(diǎn)探討了環(huán)境溫濕度條件以及煙葉含水率對(duì)片煙霉變的影響。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，片煙在 4～35℃范圍內(nèi)，溫度越高，霉變?cè)娇?，說明適宜霉菌活動(dòng)的溫度范圍較寬，與許大鳳等[9]研究結(jié)果一致。環(huán)境濕度對(duì)片煙霉變有較大影響，環(huán)境相對(duì)濕度越高，片煙越易發(fā)生霉變，當(dāng)環(huán)境相對(duì)濕度低于70%時(shí)，片煙難以發(fā)生霉變，說明霉菌生長對(duì)環(huán)境濕度要求較嚴(yán)格，與許大鳳等[9]研究結(jié)果基本一致。水分是霉菌生命活動(dòng)的必要條件，煙葉中的水分含量決定了生長微生物的種類和繁殖速度，也決定了煙葉霉變類型與速度。從本研究結(jié)果來看，片煙含水率越高，霉變速度越快，霉變程度越重。反之，含水率越低，霉變速度越慢，霉變程度越輕。事實(shí)上，環(huán)境溫度、環(huán)境濕度、片煙含水率之間相互影響，片煙霉變是三者綜合作用的結(jié)果。因此，本研究在單因素分析的基礎(chǔ)上，選擇環(huán)境溫度、濕度、片煙含水率作為實(shí)驗(yàn)要素進(jìn)行了正交試驗(yàn)。結(jié)果表明，空氣相對(duì)濕度70%，且片煙含水率15%以下，片煙不容易發(fā)生霉變。在環(huán)境濕度 75%～80%，片煙含水率低于19%，片煙易發(fā)生輕度霉變。環(huán)境濕度高于80%，或空氣相對(duì)濕度75%、片煙含水率高于19%時(shí)，片煙極易發(fā)生霉變。

綜合本研究結(jié)果，環(huán)境濕度和片煙含水率是影響片煙霉變的關(guān)鍵因素，在防霉管理中應(yīng)重點(diǎn)將這兩項(xiàng)指標(biāo)控制在安全范圍內(nèi)。

[1]朱大恒，韓錦峰，張愛萍，等.自然醇化與人工發(fā)酵對(duì)烤煙化學(xué)成分變化的影響比較研究[J].煙草科技，1999（1）：3-5.

[2]李魁，李廷生，王平諸，等.我國煙草真菌區(qū)系調(diào)查及霉變成因的研究[J].鄭州工程學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，24（3）：20-24.

[3]趙文姬.云南倉儲(chǔ)煙葉霉變與生物防治研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2004.

[4]黃福新，周興華，朱桂寧，等.廣西煙倉霉變發(fā)生狀況調(diào)查及主要霉變因素探討[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，38（4）：411-414.

[5]Abellana M, Sanchis V, Rooms A J.Effect of water activity and temperature on growth of three Penicillium species and Aspergillus flavus on a sponge cake analogure[J].International Journal of Food Microbiology,2001,71(2-3):151-157.

[6]Abramson D, Hulasare R, York R K, et al.Mycotoxins,ergosterol, and odor volatiles in durum wheat during granary storage at 16% and 20% moisture content[J].Journal of stored products research, 2004, 41: 67-76.

[7]孔凡玉，林建勝，張成省，等.儲(chǔ)煙霉變機(jī)理與防霉技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國煙草學(xué)報(bào)，2009，15（5）：78-81.

[8]朱宏建，高必達(dá)，易圖永.煙葉貯藏期霉變?cè)蚣胺烂辜夹g(shù)研究[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，13（15）：139-141.

[9]許大鳳，高正良，楊建卿，等.溫度濕度對(duì)貯藏片煙霉菌影響的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（20）：5368-5369.