焦士勇，艾常虹，李艾芳，李 樺，王 旗

(1.北京大學公共衛(wèi)生學院毒理學系，北京 100191;2.軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所，北京 100850)

中藥補骨脂為豆科植物補骨脂Psoralea corylifoliaL.的干燥成熟果實，具有溫腎助陽，納氣平喘，溫脾止瀉的功效［1］。補骨脂酚(bakuchiol)是補骨脂的主要成分之一，在補骨脂藥材中的含量為1.12%～5.14%［2］，是一種單萜類化合物，常溫下為淺黃色油狀液體，化學結構如Fig 1所示。補骨脂酚具有抗炎退熱［3］、抗菌［4］、抗病毒［5］、抗癌［6］、保肝［7］和雌激素樣作用［8］等藥理活性。

Fig 1 Chemical structure of bakuchiol

張玉順等［9］給昆明種小鼠灌胃約9.4 g·kg-1的生藥后發(fā)現(xiàn)補骨脂酚有一定的腎毒性作用。江芳等［10］在體外也觀察到 20 μmol·L-1以上濃度的補骨脂酚對人腎近曲小管上皮細胞(human kedney-2，HK-2)有明顯的腎毒性作用，加入大鼠肝勻漿S9代謝活化后，補骨脂酚的細胞毒性作用明顯降低，提示肝臟藥物代謝酶對補骨脂酚有一定的減毒作用，補骨脂酚經(jīng)代謝可能轉化為無毒或低毒的物質。補骨脂酚的代謝研究目前僅見SD大鼠口服補骨脂酚的藥代動力學［11］，補骨脂酚的肝臟代謝產(chǎn)物，代謝的種屬差異以及代謝與毒性的關系尚未見報道。為了更好地理解補骨脂酚的肝代謝與腎毒性之間的關系及實驗動物和人體之間可能存在的差異，本文用大鼠、比格犬和人肝微粒體研究了3個種屬微粒體對補骨脂酚HK-2細胞的減毒作用，以及補骨脂酚的體外肝代謝穩(wěn)定性及代謝動力學，并比較了種屬間差異。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑補骨脂酚購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，純度＞99%，批號為090427;丹參酮ⅡA(內(nèi)標)購自中國藥品生物制品檢定所;♂ SD大鼠和比格犬肝微粒體、及♂人肝微粒體均購自北京慧智泰康醫(yī)藥技術有限公司，蛋白含量為20 g·L-1，批號:7MMC002;D/F12(DMEM ∶F12=1 ∶1)培養(yǎng)基購自北京清大天一生物科技有限公司;1∶250胰蛋白酶為Amresco公司產(chǎn)品;甲醇(Sigma)和乙腈(J＆Kchemica)為色譜純，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器Waters高效液相色譜儀系統(tǒng)配有Wa-ters1525泵、717 Puls自動進樣器和2487雙波長紫外檢測器(美國Waters公司);Multiskan MK3型酶標儀(美國Thermo公司);Cary Win UV300紫外可見分光光度計(美國Agilent公司)。

1.3細胞培養(yǎng)HK-2細胞購自北京協(xié)和醫(yī)科大學，細胞培養(yǎng)用含體積分數(shù)為10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，內(nèi)含2 mmol·L-1非必需氨基酸、100 kU·L-1的青霉素和鏈霉素，于5%CO2，37℃，恒濕條件下培養(yǎng)，細胞融合80%后用胰蛋白酶/EDTA消化傳代。

1.4肝微粒體對補骨脂酚HK-2細胞毒性的影響實驗分組如下:空白對照組:不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基;溶劑對照組:體積分數(shù)為0.5%DMSO;肝微粒體對照組:蛋白濃度為0.16 g·L-1鼠(犬或人)肝微粒體+0.5%DMSO;補骨脂酚組:10、20、30、40、50 μmol·L-1;補骨脂酚 + 蛋白濃度為 0.16 g·L-1鼠(犬或人)肝微粒體組:10、20、30、40、50 μmol·L-1;含有微粒體的樣品均在冰浴上配制，每個濃度設5個平行樣。

取生長融合達80%的細胞，用質量濃度為0.5 g·L-1的胰蛋白酶消化，配制單細胞懸液，細胞密度為3×105·L-1，每孔100 μl種于96 孔板，培養(yǎng)12 h后加入100 μl上述各組受試藥物，補骨脂酚加微粒體組將受試藥與微粒體同時加入細胞培養(yǎng)液，與HK-2細胞共孵4 h后換上含有0.5 g·L-1MTT的無血清DMEM/F12培養(yǎng)液，培養(yǎng)4 h后將上清液棄去，每孔加入150 μl體積分數(shù)為4%酸性異丙醇，37℃恒溫15 min后，于570 nm用酶標儀測定各孔吸光度值，計算細胞存活率。

1.5HPLC法定量測定補骨脂酚補骨脂酚及內(nèi)標應用 XB-C18 色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm，美國Welch公司)分離，流動相為水-甲醇(11∶89，V∶V;含0.1%甲酸)，流速為1 ml·min-1，檢測波長262 nm。

1.6補骨脂酚在肝微粒體孵育體系中的代謝消除孵育體系用50 mmol·L-1K2HPO4溶液(pH=7.4)配制，其中含蛋白濃度為0.5 g·L-1的各種屬微粒體和初始濃度為10 μmol·L-1的補骨脂酚，在37℃預孵育5 min，加入同樣預孵育5 min的NADPH(10 mmol·L-1)溶液啟動反應，于0、2、5、10、20、30和60 min分別取樣，立即加入冰冷的含有內(nèi)標(0.5 μmol·L-1丹參酮ⅡA)的甲醇 -乙腈(1 ∶1，V∶V)溶液 200 μl終止反應，渦旋混勻 2 min，于20 200×g，4 ℃離心 10 min，取上清 10 μl HPLC 檢測補骨脂酚的剩余含量，計算代謝消除半衰期等參數(shù)。對照為不加NADPH的酶反應組。

1.7補骨脂酚的肝微粒體代謝動力學反應體系中各種屬微粒體蛋白含量為0.5 g·L-1，補骨脂酚的終濃度分別為2、4、8、16 和32 μmol·L-1，比格犬和人微粒體組于10 min終止反應，大鼠微粒體組因藥物轉化速率較快故于2 min終止反應。0時組先在孵育液中加入終止液后再加NADPH溶液。樣品按“1.6”節(jié)的方法處理后用HPLC檢測補骨脂酚的剩余含量，計算酶動力學參數(shù)Km和Vmax。

1.8數(shù)據(jù)處理與分析以溶劑對照組的細胞存活率為100%，由公式(1)計算實驗組的細胞存活率。

以0時的補骨脂酚濃度為100%，由不同時間點的補骨脂酚剩余濃度與0時濃度相比得到其剩余百分比。以各時間點補骨脂酚剩余百分比的自然對數(shù)對反應時間作圖，經(jīng)直線回歸求得斜率(-k)，由公式(2)得到補骨脂酚的代謝消除，應用 Wellstirred模型對微粒體的數(shù)據(jù)進行外推［12］得到補骨脂酚在人、大鼠和比格犬肝中的固有清除率CLint(ml·min-1·kg-1)和肝清除率CLh(ml·min-1·kg-1)。

其中，SF為換算因子，Gmicrs代表肝臟中含有的微粒體蛋白的平均質量(mg);Wliver代表肝重(g);Wbody代表體重(kg);Gprotein代表反應體系中蛋白濃度(mg·ml-1);Qh肝血流速。相關動物理化參數(shù)的經(jīng)驗值引自文獻［13］。

由Line weaver-Burk模型計算補骨脂酚在3個種屬微粒體中的米氏常數(shù)(Km)和最大反應速率(Vmax)。

2 結果

2.1補骨脂酚的HPLC檢測方法學及驗證在現(xiàn)有的色譜條件下，補骨脂酚及內(nèi)標峰達到基線分離，微粒體基質中的內(nèi)源物不影響其分離和定量。補骨脂酚在0.1～10 μmol·L-1的濃度范圍內(nèi)呈良好線性關系，相關系數(shù)r＞0.99，定量下限為 0.1 μmol·L-1，低、中和高 3 個濃度(2.5、5 和 10 μmol·L-1)的日內(nèi)和日間精密度分別小于3.0%和4.5%，回收率＞90%，方法能夠滿足檢測要求。

2.2不同種屬肝微粒體對補骨脂酚HK-2細胞毒性的影響以DMSO溶劑組的細胞存活率為100%，溶劑加大鼠、犬和人肝微粒體組的細胞存活率分別為溶劑組的95.9%、96.8%和96.7%，經(jīng)統(tǒng)計學分析差異無顯著性(P＞0.05)，表明肝微粒體對HK-2細胞的存活率沒有影響。

補骨脂酚組和補骨脂酚加各種屬肝微粒體組的HK-2細胞存活率見Tab 1。由表可見，補骨脂酚組在藥物濃度達到20 μmol·L-1后細胞存活率明顯下降，并在20～50 μmol·L-1的濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴關系(Fig 2)。

與補骨脂酚組相比，加入大鼠、比格犬和人肝微粒體(P＜0.01)能提高20 ～50 μmol·L-1補骨脂酚組的細胞存活率，減低補骨脂酚對HK-2細胞的毒性，即使在最高的實驗濃度(50 μmol·L-1)補骨脂酚也未表現(xiàn)出明顯的毒性(Fig 2)。所有的鼠和人肝微粒體組與對照組之間無差異(P＞0.05);而加入犬肝微粒體的 30、40、50 μmol·L-1補骨脂酚組細胞存活率均低于本組對照，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結果表明，犬肝微粒體在同等蛋白濃度水平對補骨脂酚的減毒作用要低于人和大鼠肝微粒體。

2.3補骨脂酚在大鼠、比格犬和人肝微粒體中的代謝消除將補骨脂酚分別與3個種屬肝微粒體孵育，得到的代謝消除動力學曲線見Fig 3。補骨脂酚在不加NADPH的孵育液中不發(fā)生代謝，表明其肝代謝是NADPH依賴的。補骨脂酚在3個種屬肝微粒體中均能較快地代謝消除，60 min后原藥濃度下降至50%以下，其中以大鼠肝微粒體的代謝最快，人肝微粒體的代謝最慢。補骨脂酚在大鼠肝微粒體0～30 min內(nèi)、在犬和人肝微粒體0～60 min內(nèi)呈線性消除，據(jù)此計算得到消除半衰期和內(nèi)在清除率CLint和肝清除率CLh，見Tab 2。大鼠和犬肝微粒體對補骨脂酚的代謝消除半衰期及清除率與人相比差異有顯著性(P＜0.01)。

Tab 1 Effects of bakuchiol with/without rat，dog and human liver microsomes on HK-2 cell survival after 4 h exposure(±s，n=5)

Tab 1 Effects of bakuchiol with/without rat，dog and human liver microsomes on HK-2 cell survival after 4 h exposure(±s，n=5)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs bakuchiol group at the same concentration level;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs 0.5%DMSO+LM group for each species

Concentration/μmol·L-1 bakuchiol 0.5%DMSO 100.00±1.65 105.37±5.71 103.23±7.Cell viability/%bakuchiol RLM+bakuchiol BLM+bakuchiol HLM+29 103.36±1.57 0.5%DMSO+LM - 100.00±2.57 100.00±2.03 100.00±6.19 10 96.27±2.05 96.73±4.64 101.61±8.35 98.52±4.02 20 95.21±1.31 101.33±1.02* 98.16±0.43 99.20±3.86 30 71.35±4.27 96.50±5.56＊＊ 90.46±2.01＊＊# 101.46±2.05＊＊40 37.42±2.01 97.33±3.36＊＊ 93.32±2.59＊＊## 102.51±5.44＊＊50 18.94±2.10 97.05±7.22＊＊ 90.43±1.88＊＊## 102.15±1.61＊＊

Tab 2 In vitro liver microsomal metabolic parameters of bakuchiol and predicted hepatic clearances of three species(±s，n=3)

Tab 2 In vitro liver microsomal metabolic parameters of bakuchiol and predicted hepatic clearances of three species(±s，n=3)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs human

LM Parameter T Km Vmax 12/min CLint/ml·min-1·kg-1 CLh/ml·min-1·kg-1/μmol·L-1/μmol·L-1·min -1 RLM 6.79±0.39＊＊ 365.92±20.01＊＊ 47.60±0.36＊＊ 31.89±2.60＊＊1.88±0.09 BLM 53.31±0.29＊＊ 65.16±0.35＊＊ 20.92±0.036＊＊ 89.35±4.32* 0.57±0.01 HLM 44.14±1.13 39.38±1.04 13.57±0.12 81.66±3.41 0.47±0.01＊＊

2.4補骨脂酚在大鼠、比格犬和人肝微粒體中的酶動力學將不同濃度的補骨脂酚與3個種屬肝微粒體孵育，觀察到其代謝在32μmol·L-1的濃度以下不呈飽和，故選擇補骨脂酚濃度2、4、8、16和32 μmol·L-1與0.5 g·L-1的各微粒體蛋白共同孵育，測定補骨脂酚的酶動力學參數(shù)Km和Vmax值，結果見Tab 2。補骨脂酚與大鼠肝微粒體酶的表觀親和力最高(Km值最小)，人次之，比格犬為最弱;而最大反應速度(Vm)的排序則是大鼠＞比格犬＞人。

Fig 3 In vitro metabolic kinetic of bakuchiol in liver microsomes of human，dog and rat

3 討論

前期的研究［10］發(fā)現(xiàn)，大鼠肝S9對補骨脂酚的HK-2細胞毒性有減低作用，但在藥物高濃度(40 μmol·L-1)仍表現(xiàn)出一定的腎細胞毒性。本研究用相同蛋白濃度的不同種屬肝微粒體與補骨脂酚共孵育，觀察到即使在50 μmol·L-1的高濃度，補骨脂酚對HK-2細胞也沒有明顯的腎細胞毒性。體外代謝試驗結果表明，補骨脂酚在肝微粒體中能較快代謝消除，且是依賴于NADPH的，說明肝微粒體對補骨脂酚的代謝減毒作用是由微粒體細胞色素P450酶(CYP)介導的。本課題組對代謝酶表型的初步研究證實，CYP2C19、2C9和3A4等多個 CYP酶亞型參與了補骨脂酚的肝代謝(未發(fā)表資料)，補骨脂酚經(jīng)CYP酶代謝后可能轉化成無毒或低毒的代謝產(chǎn)物。肝S9與微粒體同屬肝亞細胞成分，肝S9含有胞質和微粒體酶，將S9進一步超速離心可以得到主要含有CYP酶的肝微粒體。因此，在相同蛋白濃度水平微粒體中CYP酶的含量要高于S9，這可能是肝微粒體對高濃度補骨脂酚的減毒作用強于S9的主要原因。

補骨脂酚在大鼠、犬和人肝微粒體中均能較快地代謝消除，但其肝臟代謝消除速率和酶動力學存在一定的種屬差異。補骨脂酚在大鼠肝微粒體的代謝最快，僅為6.79 min;外推得到的大鼠內(nèi)在清除率和肝臟清除率也明顯高于比格犬和人。補骨脂酚與大鼠微粒體酶的表觀親和力最高(Km值最小)其次是人，比格犬最弱;最大反應速率Vmax則是大鼠＞比格犬＞人。

CYP同工酶在不同種屬肝臟中的組成和相對含量存在差異［14］;由于不同CYP同工酶能介導不同的代謝反應，因而CYP酶介導的代謝反應和生成的代謝產(chǎn)物種類或量也存在著種屬差異［13］。補骨脂酚在3個種屬肝微粒體中的代謝動力學性質的差異，很可能與不同種屬肝臟中與補骨脂酚代謝相關的CYP酶的分布及相對豐度的差異有關。在細胞毒性實驗中觀察到，犬肝微粒體對補骨脂酚細胞毒性的降低作用與人和大鼠相比有一定的差異，這一差異不僅與補骨脂酚在不同種屬肝微粒體的代謝動力學的差異有關，也可能與犬肝中與補骨脂酚減毒相關藥酶的分布差異相關。補骨脂酚的轉化途徑和代謝動力學的種屬差異以及對腎毒性的可能影響有必要在體內(nèi)外實驗中進一步研究。

綜上所述，肝微粒體能明顯降低補骨脂酚的HK-2細胞毒性，并與肝臟CYP酶介導的代謝相關。補骨脂酚的肝代謝動力學存在一定的種屬差異，大鼠與人有較大差異，而比格犬與人相對接近，但對高濃度補骨脂酚細胞毒性的降低作用犬和人之間存在一定的差異。因此，在補骨脂酚毒性實驗的動物選擇以及將動物實驗結果外推至人時應考慮到人和實驗動物之間的種屬差異性。

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