郭芬芬，任俊杰，王 君，武冬梅，梁月琴，呂志杰

(山西醫(yī)科大學(xué)1.藥理學(xué)教研室，2.第一醫(yī)院，山西太原 030000)

度洛西汀(duloxetine，DLX)化學(xué)名稱為:(+)-(S)-氮-甲基-γ-(1-萘氧基)-2-噻吩丙胺鹽酸鹽，是5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NE)再攝取的雙重抑制劑，通過抑制5-HT和NE再攝取發(fā)揮抗抑郁作用［1］。DLX抑制5-HT和NE的再攝取能力強(qiáng)，且作用均衡，2004年上市至今已成為全美乃至世界臨床一線抗抑郁藥，其市場(chǎng)占有率高［2］。由于對(duì)5-HT和NE再攝取的雙重抑制作用，DLX對(duì)心血管系統(tǒng)的不良反應(yīng)受到關(guān)注。國外報(bào)道，與安慰劑相比，DLX能明顯增加心率和收縮壓，Thase等［3］建議服用DLX治療抑郁癥時(shí)應(yīng)該在用藥前和用藥的整個(gè)過程中密切測(cè)量血壓。目前，對(duì)于DLX引起這些心血管不良反應(yīng)的機(jī)制未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用血管張力記錄系統(tǒng)，觀察DLX對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈舒張功能的影響并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物健康♂SD大鼠43只，體質(zhì)量(250～300)g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2藥品與試劑度洛西汀(duloxetine)，上海中西醫(yī)制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)100701，規(guī)格20 mg/片。賽庚啶(cyproheptadine)，上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司，批號(hào)100503，規(guī)格2 mg/片。哌唑嗪(prazosin)，上海信誼藥廠有限公司，批號(hào)110101 R，規(guī)格 1 mg/片。去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)，上海禾豐制藥有限公司，批號(hào)090202，規(guī)格2 mg/1 ml。以上藥品臨用前均用生理鹽水配制至所需濃度。乙酰膽堿 (acetylcholine，ACh)、Gli、TEA、BaCl2和4-AP均購自 Sigma公司。NaCl、KCl等化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3儀器BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)購自成都泰盟科技有限公司;HSS-1B數(shù)字式超級(jí)恒溫浴鍋購自成都儀器廠;張力換能器(JH-2)購自高碑店市新航機(jī)電設(shè)備有限公司。

1.2方法

1.2.1大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)的制備用鈍器擊昏大鼠，頸椎脫臼處死后，打開胸腔，分離胸主動(dòng)脈，將取下的胸主動(dòng)脈放入4℃的生理鹽溶液(PSS)(mmol·L-1:NaCl 144，KCl 5.8，MgCl21.2，CaCl22.5，葡萄糖11.1，HEPES 5，pH 7.38)中。去除血管周圍的脂肪及結(jié)締組織，將動(dòng)脈剪成3～4 mm的小段。血管環(huán)用兩根不銹鋼微型掛鉤貫穿血管管腔，橫向懸掛在10 ml浴管內(nèi)，下方固定，上方以一細(xì)鋼絲連于張力換能器，其靜息張力調(diào)節(jié)為2 g，使用BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄血管環(huán)張力變化。浴液為PSS液，浴槽中通以95%O2和5%CO2混合氣，37℃平衡1 h，每15 min換液1次。以KCl 60 mmol·L-1收縮動(dòng)脈環(huán)3次，如果前后兩次最大收縮幅度差小于5%者，認(rèn)為反應(yīng)性可重復(fù)，方可用于正式實(shí)驗(yàn)。

1.2.2去內(nèi)皮血管環(huán)的制備將修剪干凈的胸主動(dòng)脈環(huán)兩端固定，用與血管內(nèi)徑相適的棉棒從管腔擦過，連續(xù)兩次。血管環(huán)懸掛穩(wěn)定1 h后，用KCl 60 mmol·L-1刺激，達(dá)到坪值后，加入 ACh(10 μmol·L-1)。舒張幅度不超過收縮幅度5%時(shí)，認(rèn)為內(nèi)皮去除完全，可以開始實(shí)驗(yàn)。

1.2.3DLX對(duì)KCl或NE預(yù)收縮內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮大鼠主動(dòng)脈環(huán)的影響內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮的胸主動(dòng)脈環(huán)，同時(shí)一次性加入KCl(30 mmol·L-1)或NE(1 μmol·L-1)，待血管環(huán)收縮達(dá)到穩(wěn)定后，實(shí)驗(yàn)組累積加入DLX使浴管中的終濃度依次遞增為(3、10、30 和 100 μmol·L-1)，對(duì)照組加入溶劑，觀察血管反應(yīng)。各組以加入1 μmol·L-1NE或30 mmol·L-1KCl誘發(fā)的血管環(huán)的最大收縮幅度為100%，計(jì)算加入不同濃度DLX后最大舒張百分比變化，建立濃度-效應(yīng)曲線，并與溶劑對(duì)照組比較。

1.2.4鉀離子通道阻斷劑對(duì)DLX舒張作用的影響觀察鉀離子通道阻斷劑對(duì)DLX舒張血管作用的影響時(shí)，主動(dòng)脈環(huán)用KCl(30 mmol·L-1)預(yù)收縮，當(dāng)血管收縮達(dá)到坪值后，實(shí)驗(yàn)組分別加入 Gli(10 μmol·L-1)、TEA(10 mmol·L-1)、BaCl2(1 mmol·L-1)、4-AP(1 mmol·L-1)，對(duì)照組加入溶劑，待各組再次反應(yīng)達(dá)到坪值后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別累積加入 DLX(3 ～100 μmol·L-1)。

1.2.55-HT2受體阻斷劑賽庚啶和α1受體阻斷劑哌唑嗪對(duì)DLX舒張作用的影響觀察5-HT2受體阻斷劑賽庚啶和α1受體阻斷劑哌唑嗪對(duì)DLX舒張血管作用的影響時(shí)，主動(dòng)脈環(huán)用 KCl(30 mmol·L-1)預(yù)收縮，當(dāng)血管收縮達(dá)到坪值后，實(shí)驗(yàn)組分別加入賽庚啶(1 μmol·L-1)和哌唑嗪(1 μmol·L-1)，對(duì)照組加入溶劑，待各組再次反應(yīng)達(dá)到坪值后，實(shí)驗(yàn)組分別累積加入 DLX(3 ～100 μmol·L-1)。

1.2.6DLX對(duì)血管平滑肌鈣內(nèi)流和鈣釋放的影響血管穩(wěn)定后，加入 NE(1 μmol·L-1)，收縮達(dá)坪值后洗脫，平衡1 h，然后用無鈣生理鹽溶液 (含EGTA 0.5 mmol· L-1)沖洗3次，DLX組中加入DLX(100 μmol·L-1)預(yù)孵 20 min，然后加入 NE(1 μmol·L-1)，可見血管出現(xiàn)短暫的收縮，待其恢復(fù)平穩(wěn)以后，加入CaCl2(2.5 mmol·L-1)，可見血管再次收縮。對(duì)照組中加入溶劑預(yù)孵。記錄相應(yīng)血管張力并計(jì)算變化值，以1 μmol·L-1NE誘發(fā)的最大收縮幅度為100%，比較兩組中NE與CaCl2最大收縮百分比的變化值。

1.3結(jié)果表示及統(tǒng)計(jì)分析以加入1 μmol·L-1NE或30 mmol·L-1KCl誘發(fā)的血管環(huán)的最大收縮幅度為100%，計(jì)算加入不同濃度DLX后張力變化百分比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以±s表示。應(yīng)用SPSS 16.0作統(tǒng)計(jì)分析，兩樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1DLX對(duì)內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮主動(dòng)脈環(huán)預(yù)收縮的影響DLX在(3～100 μmol·L-1)的濃度范圍內(nèi)對(duì)內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮的大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)均具有濃度依賴性舒張作用(P＜0.01)。DLX對(duì)內(nèi)皮完整組與去內(nèi)皮組血管之間的舒張差異無顯著性，KCl和NE預(yù)刺激內(nèi)皮完整組和去內(nèi)皮組最大舒張Emax分別為(-79.85±2.45)%、(-82.13±8.55)% 和(-85.71±2.92)%、(-80.53±9.04)%，說明DLX的血管舒張作用無內(nèi)皮依賴性。見Fig 1。

Fig 1 Effect of duloxetine on the contraction induced by KCl(30 mmol·L －1，A)and NE(1 μmol· L －1，B)in isolated thoracic aortic rings with intact endothelium or without endothelium in rats(±s，n=6).＊＊P＜0.01 indicates significant differences of arterial rings intact endothelium or without endothelium from control.

2.2鉀離子通道阻斷劑對(duì)DLX舒張作用的影響在KCl(30 mmol·L-1)預(yù)收縮的血管環(huán)上，加入K+通道阻斷劑Gli、TEA、BaCl2和4-AP，對(duì)DLX舒血管作用無影響，Gli阻斷組 Emax=(-82.01±5.84)%、TEA阻斷組Emax=(-81.35±1.12)%、BaCl2阻斷組Emax=(-77.80±1.57)%、4-AP阻斷組Emax=(-81.48±2.94)%。鉀離子通道阻斷劑不能抑制其血管舒張作用，DLX舒張血管可能與鉀離子通道激活無關(guān)。見Fig 2。

Fig 2 Effects of Gli(10 μmol·L －1)，TEA(10 mmol· L －1)，BaCl2(1 mmol·L －1)，4-AP(1 mmol·L －1)on the relaxation induced by duloxetine in isolated thoracic aortic rings pre-contracted with KCl(30 mmol·L －1)(ˉx ± s，n=6)

2.35-HT2受體阻斷劑賽庚啶和α1受體阻斷劑哌唑嗪對(duì)鹽酸度洛西汀舒張作用的影響在KCl(30 mmol·L-1)預(yù)收縮血管環(huán)上，5-HT2受體阻斷劑賽庚啶組對(duì)DLX舒血管作用無影響，其Emax=(-75.05±2.90)%。α1受體阻斷劑哌唑嗪組對(duì)DLX舒血管作用有抑制作用，其 Emax=(-55.98±3.10)%(P＜0.01)。見Fig 3。

2.4DLX對(duì)血管平滑肌外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放的影響在無鈣的生理鹽溶液中，分別加入DLX(100 μmol· L-1)及溶液預(yù)孵20 min，加入 NE(1 μmol·L-1)，血管發(fā)生短暫的收縮，DLX組和溶劑對(duì)照組NE的收縮百分比分別為(6.88±1.26)、(24.09±4.17)，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見Fig 4。血管恢復(fù)平穩(wěn)以后，加入 CaCl2(2.5 mmol·L-1)，DLX組和溶劑對(duì)照組CaCl2的收縮百分比分別為(15.29±2.22)、(89.00±2.34)，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見Fig 5。

3 討論

NE作用于血管平滑肌上的α1腎上腺素受體，受體操縱性鈣通道(receptor operated calcium channel，ROC)［4］開放，細(xì)胞外 Ca2+內(nèi)流，同時(shí)激活磷脂酶C，引起膜磷脂酰肌醇水解，產(chǎn)生三磷酸肌醇，作用于肌漿網(wǎng)的三磷酸肌醇受體，促使肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+釋放［5］;高鉀引起血管平滑肌細(xì)胞膜去極化而刺激電壓依賴性鈣通道(voltage dependent calcium channel，VDC)開放，從而促使細(xì)胞外液中或與細(xì)胞膜疏松結(jié)合的Ca2+內(nèi)流［6］。二者均通過細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的增加而產(chǎn)生血管收縮。本實(shí)驗(yàn)觀察到，DLX對(duì)NE或KCl預(yù)收縮的血管環(huán)具有直接舒張作用，表明DLX舒張血管可能與細(xì)胞膜上VDC和ROC通道有關(guān)。內(nèi)皮完整與去內(nèi)皮血管相比，其舒張作用沒有差異，表明DLX所致的血管舒張與內(nèi)皮無關(guān)。

Fig 3 Effects of cyproheptadine(1 μmol·L －1，A)and prazosin(1 μmol·L －1，B)on the relaxation induced by duloxetine in isolated thoracic aortic rings pre-contracted with KCl(30 mmol·L －1)(±s，n=6).*P＜0.05，＊＊P＜0.01

Fig 4 Effect of duloxetine on the NE-induced(1 μmol·L －1)contraction of rat thoracic aortic rings in free-Ca2+PSS(±s，n=6).

Fig 5 Effect of duloxetine on the NE-induced(1 μmol·L －1)contraction of rat thoracic aortic rings with CaCl22.5 mmol·L－1(±s，n=6).＊＊P ＜ 0.01 indicates significant differences of arterial rings pretreated with duloxetine from control

本實(shí)驗(yàn)觀察到 KATP阻斷劑 Gli、BKCa阻斷劑TEA、Kir阻斷劑 BaCl2和Kv阻斷劑4-AP均不能抑制DLX的舒張血管作用，推測(cè)DLX舒張血管作用與鉀通道無關(guān)。

其次觀察到5-HT2受體阻斷劑賽庚啶不能抑制DLX的舒張血管作用，推測(cè)DLX舒張血管作用與拮抗5-HT2受體無關(guān)。血管平滑肌上的α1腎上腺素受體被激活時(shí)，通過觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的Ca2+釋放和細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流引起胞質(zhì)游離Ca2+濃度升高［7］，從而引起平滑肌收縮。本實(shí)驗(yàn)觀察到選擇性的α1受體阻斷劑哌唑嗪能部分抑制DLX的舒張血管作用，表明DLX舒張血管作用與拮抗α1受體有關(guān)。

在無鈣的生理鹽溶液中，加入NE可以引起血管短暫而快速的收縮，其收縮作用是內(nèi)鈣釋放的結(jié)果［8］。隨后在浴液中加入CaCl2后，血管再次收縮達(dá)峰值，其收縮作用是外鈣內(nèi)流的結(jié)果［9］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，提前用DLX預(yù)孵后，NE收縮血管的幅度明顯降低，加入CaCl2后再次收縮達(dá)峰值的幅度也明顯降低，進(jìn)一步證明DLX是通過抑制外鈣內(nèi)流來舒張血管，同時(shí)也通過抑制內(nèi)鈣釋放來舒張血管。

綜上，DLX對(duì)KCl或NE預(yù)刺激的血管環(huán)的舒張作用可能是通過抑制經(jīng)由血管平滑肌細(xì)胞膜VDC和ROC通道的鈣離子內(nèi)流，拮抗α1受體以及抑制胞質(zhì)內(nèi)鈣離子釋放而發(fā)揮作用的。DLX的這種對(duì)離體血管的直接舒張作用，是否與臨床報(bào)道的DLX的心血管反應(yīng)有關(guān)，其詳細(xì)機(jī)制還有待進(jìn)一步深入探討。

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