鄒 曉，瞿嬌嬌，劉清興，劉愛英

（貴州大學生命科學學院，真菌資源研究所，貴陽 花溪 550025）

關于微生物對煙葉醇化的影響，Koller最早進行了添加微生物以提高雪茄煙香氣和吃味的嘗試[1]。通過在雪茄煙中添加酵母菌可加速發(fā)酵進行，但同時也會促進細菌和霉菌生長。Tamayo AI等發(fā)現，用微生物接種的煙葉，香氣和性狀均得到改善，尤其是當采用微球菌屬 （Micrococcus）或桿菌屬 （Bacillus）或兩者的混合物接種煙葉時，效果更為顯著[2]。在國內，陳福星等用從烤煙煙葉上分離鑒定的4個優(yōu)勢菌種 （均屬芽孢桿菌科的細菌）處理煙葉后不僅大大縮短了發(fā)酵時間，而且使煙葉品質及色香味均有一定的提高[3]。韓錦峰等將由烤煙葉面分離篩選的芽孢桿菌屬 （Bacillus）和梭狀芽孢桿菌屬 （Clostridium）優(yōu)勢菌種，混合配制成生物制劑 （TFA）用于煙葉發(fā)酵，結果表明，TFA可加速烤煙發(fā)酵，提高煙葉品質，并且具有抑制煙葉霉變的作用[4]。謝和等施加微生物的煙葉發(fā)酵后，青雜氣減少，刺激性有所降低，香味略有增加，余味舒適[5]。

關于微生物對煙葉的醇化研究，除了一些利用酵母改善煙草品質影響的研究外，關于絲狀真菌改善煙葉質量的研究不多[5]。食用菌是一類含有豐富酶系的絲狀真菌，特別是其中的木素酶可對煙葉中的木質素有較好的降解效果[6]，通常煙葉中的木質素熱解會產生一些影響吸味并且致癌的物質[7]。利用食用菌來定向改善煙葉品質、減害、縮短醇化時間是本次試驗的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

白平菇P339（Pleurotus ostreatus），編號：Z-3；黃傘(Pholiota adipose)，編號：Z-4；糙皮側耳 （Pleurotus ostreatus）， 編號：Z-6； 珠星平菇 （Pleurotus ostreatus）， 編號：Z－7； 蘇香菌 （Lentinula edodes）編號： Z－15； 啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）， 編號 Z－8； 面包酵母 （Saccharomyces cerevisiae），編號：Z－9。以上菌株現保存于貴州大學真菌資源研究所。

1.1.2 煙葉

品種云85，等級B3F，來自貴州省煙草公司福泉基地。

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g（切塊，沸水煮30 min，4層紗布過濾取汁）、葡萄糖20 g、瓊脂 20 g，水1 000 mL，pH自然，121℃滅菌30 min。加瓊脂20 g即為固體培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)食用菌。

麥芽汁培養(yǎng)基：麥芽汁 1 000 mL，波美度 5.5，pH 6.5，118℃滅菌20 min。加瓊脂20 g即為固體培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)酵母菌。

1.2 方法

1.2.1 煙葉處理

將煙葉去掉主葉脈分為兩半，一半用于接種微生物，另一半做對照。每15片煙葉接1個菌種。放入培養(yǎng)食用菌的塑料袋中封口并加壓蒸汽滅菌，110℃滅菌20 min。

1.2.2 菌懸液的制備

取20個50 mL三角瓶裝15粒左右玻璃珠，加入自來水30 mL，滅菌。滅15個空食用菌塑料袋，以便接種后盛裝煙葉進行發(fā)酵。10支毛筆滅菌后，用于接種。滅1 mL型移液槍頭1盒。滅菌參數118℃、30 min，待上述菌種斜面培養(yǎng)1個星期后觀察生長情況，選取生長情況較好的菌種制成菌懸液。取適量無菌水加入相應的試管，沖洗，振蕩，然后倒入50 mL三角瓶中在搖床上振蕩40 min。 參數 26℃， 150 r·min－1。

1.2.3 接種

超凈工作臺上，將食用菌塑料袋中滅菌的煙葉取出，用毛筆醮菌懸液均勻涂抹于煙葉表面。將接種后的煙葉放回無菌的食用菌塑料袋中。對照煙葉用無菌水代替菌懸液，其它處理相同。溫度30℃、空氣濕度 (70±2)%發(fā)酵培養(yǎng) 50 d。

1.2.4 測試方法

煙葉理化分析參見王瑞新[9，10]；煙葉評吸由貴州中煙公司技術中心組織進行。

2 結果與分析

2.1 煙葉蒸汽滅菌后的顏色和香味變化

煙葉滅菌后顏色及香味變化情況，見表1、表2。

表1 煙葉滅菌后顏色變化情況

表2 滅菌后煙葉香味增加程度

煙葉滅菌后顏色隨著滅菌時間和溫度增加呈現出顏色逐漸情況，由最初的榴萼黃到栗棕色。其原因是在煙葉滅菌和滅酶的過程中，氨基酸和葡萄糖聚合發(fā)生了美拉德反應，形成了具有顏色的類黑精，使得煙葉的顏色發(fā)生了變化。從表1中也可以看到，若保持煙葉顏色不變化則滅菌溫度不能超過100℃，時間不宜超過15 min。滅菌后除了顏色發(fā)生變化，滅菌煙葉的嗅覺香味也發(fā)生明顯變化，其趨勢變化與顏色變化一致。Nishi OA等曾用美拉德反應得到的棕化產物處理卷煙使香味增強，煙氣協調醇和，刺激性減小[11]。Wu DL等也通過梅拉德反應結合增效劑，研制成新型煙用增香劑[12]。

2.2 煙葉發(fā)酵后的理化檢測結果

煙葉發(fā)酵后理化分析檢測結果見表3。

表3 煙葉發(fā)酵后理化分析檢測結果

煙葉經過發(fā)酵后煙堿的含量比空白對照略有提高，增加幅度最大為Z－10，其水溶性總糖也降低最多，該菌株為啤酒酵母，酵母本身適合生產生物堿，其生物堿的累積增加了對煙堿測定的干擾。煙堿增加說明了微生物活動確實會影響煙葉的理化性質。另一株值得關注是Z－7菌株，對煙葉的煙堿和總氮影響不大，但是對水溶性總糖提高明顯對煙葉理化指標改善明顯。另外經過微生物處理后的煙葉，會形成比較有特點的煙葉，糖/堿和氮/堿變化較大。

2.3 煙葉發(fā)酵后的評吸結果

接種真菌發(fā)酵后煙葉評吸分值情況見表4。

檢測煙葉醇化狀態(tài)，其中很重要的手段就是對煙葉進行人工評吸。根據表4可以看出趨勢，食用菌處理的樣品在香氣 （質、量）、吃味、刺激性上比對照都有所改善。改善效果最明顯是Z－7菌株，其得分最高綜合評價也最好，結合表3結果Z－7菌株對水溶性多糖提高明顯，該菌株可以進一步開發(fā)。食用菌發(fā)酵煙葉另一個明顯的效果就是對煙葉雜氣的去除，表4中的Z-6菌株、Z-7菌株、Z-15菌株相比于對照和滅菌對照煙葉雜氣都有不同程度的減少。由于煙葉經過滅菌處理其顏色上距離工業(yè)生產要求較大，未給外觀評價打分，致使評吸總得分不高，但所用菌株對煙葉質量改善已經很明顯。

表4 接種真菌發(fā)酵后煙葉評吸分值表

3 討論

能夠對煙葉增香的濕熱滅菌值得關注，由于非酶褐變反應產生了許多有香味的化學物質，可在一定程度改善初烤煙葉品質。香氣物質的主要來源為糖類物質在高溫條件下與氨基酸反應生成的。但在此過程中需注意煙葉顏色等外觀指標，外觀顏色和內在品質之間需要找到一個平衡點。如果不考慮煙葉外觀，高壓、濕熱蒸汽處理煙葉，對改善煙葉內在品質效果明顯。

關于微生物醇化煙葉的研究很多，Reid等在研究雪茄煙發(fā)酵過程時發(fā)現，微生物的活動比較活躍，與發(fā)酵強度和發(fā)酵質量有一定關系，并發(fā)現了一些煙葉醇化過程中的微生物[13]。后來的一些報道大都集中在從煙葉本身分離微生物，包括酵母、絲狀真菌、細菌等[14]。我國有悠久微生物應用的歷史，可供選擇的微生物很多，因此開發(fā)新的微生物資源用于煙草醇化工業(yè)很有前景。文中也發(fā)現了1株Z-7的食用菌菌株取得較好的評吸效果，如果擴大篩選資源會發(fā)現更多的醇化資源。利用這些微生物資源要以安全和有特色為主，如降害、增香等特色微生物。在煙葉醇化的環(huán)境下 （溫度35℃左右，RH＜75%），對合適的微生物進行育種篩選也是必要的。

文中結果顯示，平菇 Pleurotus ostrea的一株菌有較好的醇化效果，但在降害方面效果不夠顯著。因此研究各種微生物如何協調統(tǒng)一發(fā)酵煙葉也是應用研究的好思路，簡單的幾株菌就可能組合出很有特色的配方。而煙葉的自然醇化又是一個涉及生物、化學、環(huán)境等多種因素協同作用的結果。存放的環(huán)境條件和所存放的煙葉種類決定了煙葉上微生物的豐度和種類及其演化過程，而這些微生物的代謝和演化活動很大程度上決定了煙葉的醇化品質。從自然醇化好的煙葉發(fā)現新的微生物資源，特別是一些絲狀真菌資源仍將是一個有前景的研究方面。

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