王 遂 劉夢(mèng)然 黃海嬌 穆懷志 李志新 劉桂豐

(林木遺傳育種與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

晚期胚胎發(fā)育豐富蛋白(Late－embryogenesis－abundant protein，簡(jiǎn)稱LEA蛋白)，是植物胚胎發(fā)育后期種子中大量積累的一系列小分子特異多肽，且可以被低溫、滲透脅迫、外源脫落酸(ABA)等因素誘導(dǎo)。LEA蛋白被認(rèn)為是在非生物脅迫過程中對(duì)植物起保護(hù)作用的物質(zhì)之一，具有穩(wěn)定細(xì)胞膜等作用［1］。由于LEA蛋白對(duì)植物的重要作用，受到廣泛關(guān)注，人們紛紛克隆該基因并進(jìn)行植物轉(zhuǎn)基因研究［2］。大量研究證明，外源LEA基因的轉(zhuǎn)入，在一定程度上提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗旱、耐鹽堿、抗寒等抗逆性，LEA蛋白現(xiàn)已成為逆境生理學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)［3］。2004年，林木遺傳育種與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得了轉(zhuǎn)TaLEA基因小黑楊(Poplus simonii×P.nigra);后續(xù)的系列研究表明，這些轉(zhuǎn)基因株系抗旱、耐鹽性均有不同程度的提高［2］，在此基礎(chǔ)上，筆者對(duì)轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊進(jìn)行了低溫脅迫試驗(yàn)，擬通過抗氧化酶類活性的變化、冷害情況、相對(duì)高生長(zhǎng)以及葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)等指標(biāo)，評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因小黑楊抗寒能力，篩選耐低溫的優(yōu)良株系，為深入研究TaLEA基因的抗寒功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

將轉(zhuǎn) LEA基因小黑楊 11個(gè)株系(XL01、XL03、XL04、XL05、XL06、XL07、XL09、XL10、XL11、XL13、XL14)和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗?WT)定植于東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種基地，2010年5月初將各參試株系分別剪取50～75個(gè)，共700個(gè)插條，于塑料大棚中扦插擴(kuò)繁，8月初從各株系中選取長(zhǎng)勢(shì)基本相同的苗木15～30株，移至人工氣候室進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 方法

低溫脅迫:人工氣候室內(nèi)的溫度由28℃開始，每日降低2℃，直至4℃，并在4℃維持3 d后，開始測(cè)定各指標(biāo)。

丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度、過氧化物酶(POD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性的測(cè)定:從各參試株系中分別選取15棵植株，每一植株取一片位置基本相同的功能葉，混樣后進(jìn)行生理指標(biāo)的測(cè)定。采用分光光度計(jì)法測(cè)定MDA的質(zhì)量摩爾濃度［4］、POD 活性［5］、CAT 活性［6］。每個(gè)株系重復(fù)3 次。

相對(duì)高生長(zhǎng)的測(cè)定:參試材料移至人工氣候室低溫脅迫前后，分別測(cè)量植株高度，求算相對(duì)高生長(zhǎng)，公式如下:

葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定:采用SPAD502型葉綠素儀(日本)分別測(cè)定低溫脅迫前后參試株系的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，各株系選擇位置基本相同的功能葉，各株系測(cè)定3個(gè)葉片。

冷害指數(shù)的評(píng)定:于低溫脅迫結(jié)束后對(duì)參試株系進(jìn)行冷害情況調(diào)查，計(jì)算冷害指數(shù)，公式如下:

根據(jù)下列指標(biāo)確定冷害級(jí)別:

無冷害癥狀為0級(jí);

輕度冷害(無凍稍，少部分葉尖枯黃，落葉數(shù)占總?cè)~數(shù)的20%以內(nèi))為1級(jí);

中度冷害(有稍許凍稍，部分葉邊緣枯黃，落葉數(shù)占總?cè)~數(shù)的20%～50%)為2級(jí);

重度冷害(有明顯凍稍，大部分葉枯黃，落葉數(shù)占總?cè)~數(shù)的50%～80%)為3級(jí);

極重度冷害(凍稍嚴(yán)重，葉子全部枯黃，落葉數(shù)占總?cè)~數(shù)的80%以上)為4級(jí)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析系統(tǒng)和Excel軟件進(jìn)行方差分析及多重比較，采用模糊數(shù)學(xué)中隸屬函數(shù)法選擇優(yōu)良轉(zhuǎn)基因株系［7］。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下各株系MDA質(zhì)量摩爾濃度的比較

植物遭遇逆境或處于衰老的過程中，生物膜的破壞是由細(xì)胞產(chǎn)生的超氧自由基誘導(dǎo)脂質(zhì)中的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化造成的［8］。MDA是膜脂過氧化作用的產(chǎn)物，通常將其作為評(píng)判脂質(zhì)過氧化損傷程度的指標(biāo)之一。逆境下，MDA積累越多，表明細(xì)胞膜脂過氧化程度越高，細(xì)胞膜受損越嚴(yán)重。

對(duì)各轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗?WT)的差異顯著性分析顯示，脅迫前后MDA質(zhì)量摩爾濃度的差異顯著(P＜0.05)。進(jìn)一步的多重比較表明，脅迫前MDA的質(zhì)量摩爾濃度除XL09外，其他各株系間差異不明顯。而低溫脅迫后，各株系間的MDA質(zhì)量摩爾濃度變化顯著，除XL09略高于WT外，其余各轉(zhuǎn)基因株系均低于WT。轉(zhuǎn)基因株系MDA質(zhì)量摩爾濃度的平均值為 35.209 μmol·g－1(表 1)，低于對(duì)照 16.5%。XL11、XL10、XL14、XL04、XL13 株系顯著低于 WT，其中 XL11和XL10的MDA質(zhì)量摩爾濃度最低，分別為24.811、25.085 μmol·g－1。低溫脅迫條件下，除XL09外，各轉(zhuǎn)基因小黑楊株系的膜質(zhì)過氧化程度都低于WT，表明其細(xì)胞膜受損較輕。

表1 低溫脅迫前后各株系的MDA質(zhì)量摩爾濃度、POD活性、CAT活性的比較

2.2 低溫脅迫下各株系POD活性的變化

POD是植物體內(nèi)擔(dān)負(fù)清除H2O2的主要酶類之一，POD能催化H2O2氧化其他底物生成H2O。POD作為植物體內(nèi)消除氧自由基傷害的防御酶系成員之一，與植物的抗逆境能力密切相關(guān)［9］。

低溫脅迫前后，POD活性在參試株系間的差異均顯著(P＜0.001)。通常認(rèn)為，POD活性降幅小的株系抗逆性較強(qiáng)［10］。為此，根據(jù)脅迫前后POD活性的變化對(duì)參試株系進(jìn)行抗寒性評(píng)價(jià)，結(jié)果表明:只有XL10、XL11下降幅度最小，均為78.2%;WT的降幅次之，為78.7%;降幅在80.0%～90.0%之間的有XL13、XL14、XL03、XL05;其余株系 POD 降幅較大，均在 90.0%以上(表1)。

2.3 低溫脅迫下各株系CAT活性的變化

CAT是一種酶類清除劑，可促使H2O2分解為分子氧和水，從而使細(xì)胞免于遭受H2O2的傷害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。

參試各株系的CAT活性在低溫脅迫前后株系間的差異均顯著(P＜0.001)。非低溫脅迫條件下，各株系的CAT活性均維持在一個(gè)比較低的水平。低溫脅迫后，各株系的CAT活性均有不同程度的上升，其中:XL10和XL04上升幅度較大，分別為脅迫前的1129.2%和902.6%;其余各株系間均無顯著性差異。低溫脅迫后11個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的CAT活性平均值為14.634 U·g－1，略高于 WT 的12.560 U·g－1(表1)。

2.4 低溫脅迫下各株系相對(duì)高生長(zhǎng)比較

小黑楊為典型的全期生長(zhǎng)型植物，當(dāng)氣溫降低時(shí)，高生長(zhǎng)迅速降低，同時(shí)，植株充分木質(zhì)化，積累抗寒物質(zhì)，為渡過低溫時(shí)期做好準(zhǔn)備。因此，植株相對(duì)高生長(zhǎng)的大小是其抗寒性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)。

參試株系經(jīng)低溫脅迫處理后，各轉(zhuǎn)基因株系的相對(duì)高生長(zhǎng)量在4.0%～15.3%之間，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗禐?.2%(表2)。經(jīng) t檢驗(yàn)顯示，t=4.873，P=0.01 ＜0.05，表明各轉(zhuǎn)基因株系的相對(duì)高生長(zhǎng)明顯高于WT。其中:XL03的相對(duì)高生長(zhǎng)最大，為 15.3%;XL07、XL09、XL11、XL04、XL01、XL05、XL14株系的相對(duì)高生長(zhǎng)在5.0%～10.0%之間;XL10和XL13相對(duì)高生長(zhǎng)量較小，均為4.41%。

2.5 低溫脅迫下各株系的冷害指數(shù)

低溫影響葉綠素的生物合成和光合進(jìn)程，淀粉水解以及葉綠素的光氧化，使綠葉退色成黃白［11］。同時(shí)，葉柄離區(qū)活躍，葉片開始脫落。本試驗(yàn)選取3個(gè)最典型的植物冷害癥狀，用來計(jì)算植物的冷害指數(shù)。

對(duì)參試株系的冷害情況分析發(fā)現(xiàn)，各轉(zhuǎn)基因株系中除XL03的冷害指數(shù)高于WT外，其余的株系均低于WT(表2)。其中:XL07、XL11、XL13、XL14株系的冷害指數(shù)較低，分別為0.21、0.15、0.18、0.21，表明這些轉(zhuǎn)基因株系抗寒性較強(qiáng)。

表2 低溫脅迫下各株系相對(duì)高生長(zhǎng)、冷害指數(shù)

2.6 低溫脅迫下各株系的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較

葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)是影響光合作用的重要因素，多種脅迫可使葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低［12］，因此，葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以作為植物抗性強(qiáng)弱的標(biāo)志之一。

低溫脅迫前后，參試各株系葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異均顯著(P＜0.01)。多重比較表明，脅迫前，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗档娜~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與 XL13、XL14、XL09、XL01、XL07、XL04 轉(zhuǎn)基因株系差異不明顯，而其余各轉(zhuǎn)基因株系的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)則顯著高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?表3)。就平均值來看，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗档娜~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為39.7 mg·g－1，與11個(gè)轉(zhuǎn)基因株系葉綠素平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)的40.4 mg·g－1差距不大。低溫脅迫后，各株系葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均下降，其中:XL01下降的幅度最大，為18.69%;WT降幅第二，為16.88%;而各轉(zhuǎn)基因株系的葉綠素下降幅度在8.20%～16.30%之間。多重比較的結(jié)果顯示，除XL01、XL04、XL09外，其余轉(zhuǎn)基因株系脅迫后葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著高于WT，表明低溫脅迫對(duì)多數(shù)轉(zhuǎn)基因株系的葉綠素合成影響小于對(duì)照株系。全體轉(zhuǎn)基因株系葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的平均值為35.1 mg·g－1，亦高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗档?3.0 mg·g－1，表明在低溫脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系具有明顯的優(yōu)越性。

表3 低溫脅迫前后各株系葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.7 抗寒性生理指標(biāo)綜合評(píng)定

從低溫脅迫后生理指標(biāo)中選出與抗寒性相關(guān)、具有代表性的幾個(gè)指標(biāo)進(jìn)行分析，并采用模糊數(shù)學(xué)中隸屬函數(shù)值的方法，對(duì)轉(zhuǎn)LEA基因各株系和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗档目购圆町惽闆r進(jìn)行綜合評(píng)定(表4)。

表4 各株系抗寒性綜合評(píng)定

從表4中可以看出，各株系的隸屬函數(shù)值以XL11最大，XL09最小。7個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的隸屬函數(shù)值高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗?，僅4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系低于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ铡Ｆ渲蠿L11、XL10、XL14、XL04轉(zhuǎn)基因株系的隸屬函數(shù)值較大，具有較好的抗寒性。

3 結(jié)論與討論

對(duì)植物的抗寒性鑒定已有諸多報(bào)道，其中MDA質(zhì)量摩爾濃度的變化是反映低溫脅迫下質(zhì)膜穩(wěn)定性和植物抗寒性的一個(gè)重要指標(biāo)，研究已證明，MDA質(zhì)量摩爾濃度的增加與組織受傷害程度顯著正相關(guān)［13－15］。

低溫脅迫下參試株系的細(xì)胞膜損傷測(cè)定顯示，各株系MDA 質(zhì)量摩爾濃度差異較大，XL11、XL10、XL14、XL04、XL13與WT之間達(dá)到了顯著的水平。其中:XL11和XL10株系的MDA質(zhì)量摩爾濃度最低，分別低于WT的41.2%和40.5%，表明XL11和XL10株系的細(xì)胞膜損傷程度最小，而XL14、XL04和XL13株系次之。從MDA質(zhì)量摩爾濃度方面比較可見，XL11、XL10、XL14、XL04、XL13 轉(zhuǎn)基因株系在低溫脅迫下細(xì)胞膜受到的傷害輕于WT。而在林木遺傳育種與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))前期所做的轉(zhuǎn)LEA基因煙草的抗寒性試驗(yàn)亦表明，LEA基因的導(dǎo)入，不同程度地減輕了低溫下煙草細(xì)胞膜的傷害［16］。

植物抗氧化脅迫的能力與其抗逆性之間是呈正相關(guān)的關(guān)系［17］，在逆境脅迫條件下，植物體內(nèi)自由基增多，使細(xì)胞膜產(chǎn)生過氧化，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜的損傷。POD與CAT等共同組成了植物體內(nèi)活性氧的防御系統(tǒng)，在清除超氧自由基、H2O2等方面發(fā)揮著重要作用。低溫脅迫前后POD活性的變化分析表明，只有 XL10、XL11下降幅度最小，均為78.2%(表 1)。低溫脅迫后，各株系的 CAT活性均明顯升高，其中 XL01、XL07、XL03、XL10、XL04 的 CAT 活性高于 WT，XL11 亦與 WT相差不大，為WT的97.4%。從脅迫前后的POD與CAT活性來看，只有XL10和XL11株系具有較好的抗氧化性。對(duì)遺傳背景完全相同的小黑楊轉(zhuǎn)基因株系來說，11個(gè)株系的抗氧化能力差異顯著，推測(cè)是外源LEA基因的插入位)點(diǎn)不同，可能發(fā)生插入突變或轉(zhuǎn)基因沉默，致使有些轉(zhuǎn)基因株系的POD與CAT活性較低。

植物受低溫脅迫時(shí)，木質(zhì)化進(jìn)程將加快，并逐漸停止高生長(zhǎng)以增強(qiáng)抗低溫的能力。一般認(rèn)為，植物的相對(duì)高生長(zhǎng)愈小、愈早木質(zhì)化，抗性愈強(qiáng)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，參試株系中，非轉(zhuǎn)基因株系的相對(duì)高生長(zhǎng)最小，僅為3.2%，但是其冷害指數(shù)明顯高于各轉(zhuǎn)基因株系(XL03除外)，故認(rèn)為L(zhǎng)EA基因的導(dǎo)入提高了小黑楊的抗寒能力，使其形成頂芽的時(shí)間推遲，導(dǎo)致生長(zhǎng)期延長(zhǎng)。

葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的高低也是評(píng)價(jià)植物抗寒性的另一重要指標(biāo)。低溫脅迫下植物葉綠素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高，則有利于光合作用順利進(jìn)行，使有機(jī)物積累，滲透勢(shì)下降，細(xì)胞保水力提高，從而增強(qiáng)植物的抗寒性。對(duì)11個(gè)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因株系的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較發(fā)現(xiàn)，XL11、XL03、XL07、XL14、XL10 株系脅迫后的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)仍然較高，說明低溫脅迫下這些株系能維持較高的光合速率。

對(duì)植物抗寒性的研究，如果孤立地采用形態(tài)、生理生化和代謝等單一指標(biāo)進(jìn)行抗寒性鑒定，很難反映植物抗寒的實(shí)質(zhì)。植物的生理過程是錯(cuò)綜復(fù)雜的，其抗寒性受多種因素影響，為了克服單個(gè)指標(biāo)鑒定的不足，筆者采用模糊隸屬函數(shù)法，根據(jù)測(cè)定的抗寒性指標(biāo)對(duì)轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊的抗寒性進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)。其中，轉(zhuǎn)基因株系中的XL11、XL10、XL14和XL04綜合評(píng)定指標(biāo)較好，具備進(jìn)一步推廣試驗(yàn)的潛力，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)加以驗(yàn)證。

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