方 文,肖靚靚,包懷恩,牟 榮

(1.貴陽醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系,貴州貴陽 550004;2.貴陽醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室,貴州貴陽 550004)

豬囊尾蚴基質(zhì)金屬蛋白酶-9在豬肌肉和腦組織的表達(dá)分布*

方 文1,肖靚靚2,包懷恩2,牟 榮2

(1.貴陽醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系,貴州貴陽 550004;2.貴陽醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室,貴州貴陽 550004)

應(yīng)用免疫組化分析豬囊尾蚴基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達(dá)。用豬帶絳蟲卵1 mL(8萬個(gè)/mL)灌胃20 d齡健康乳豬6頭,于感染后40、80、120 d分別宰殺2頭豬并取含囊尾蚴的肌肉及腦組織制作4 μ m厚石蠟切片,采用Envision二步法,觀察不同時(shí)期寄生在肌肉及腦組織的豬囊尾蚴基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達(dá)。結(jié)果顯示,不同時(shí)期寄生在肌肉及腦組織的豬囊尾蚴均表達(dá)MMP-9,隨著感染時(shí)間增加,各組織豬囊尾蚴MMP-9的表達(dá)均變化不大(P＞0.05),寄生在腦組織的豬囊尾蚴MMP-9的表達(dá)要略高于同期寄生在肌肉組織的豬囊尾蚴MMP-9的表達(dá)(P＜0.05)。感染部位組織學(xué)特征不同,豬囊尾蚴MMP-9的表達(dá)略有差異。

豬囊尾蚴;基質(zhì)金屬蛋白酶-9;免疫組化

金屬蛋白酶(metalloproteinase,MP)是蟲體活性中心依賴于金屬離子的一類蛋白酶,在寄生蟲中分布非常廣泛,功能涉及寄生蟲營養(yǎng)攝取、細(xì)胞分化、對(duì)宿主的入侵以及免疫逃避等許多方面,一些金屬蛋白酶還具有比較強(qiáng)的免疫原性[1]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)是一組含鋅的能降解細(xì)胞外基質(zhì)的中性蛋白酶家族。目前認(rèn)為MMP尤其是明膠酶(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染關(guān)系密切,通常以酶原的形式存在,一旦活化,則迅速攻擊血腦屏障,降解基底膜的一些基質(zhì)蛋白,破壞內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接蛋白,促進(jìn)腦水腫的形成和炎細(xì)胞的浸潤,被認(rèn)為是參與破壞血腦屏障的主要基質(zhì)金屬蛋白酶[2]。為了解豬帶絳蟲入侵中間宿主家豬后,腦組織寄生的豬囊尾蚴與肌肉組織寄生的豬囊尾蚴MMP-9的表達(dá)情況有何不同,進(jìn)行了此項(xiàng)試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 20日齡三元雜交乳豬6頭,體重6.5 kg～7 kg,購自貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物養(yǎng)殖中心,經(jīng)糞檢和間接血凝實(shí)驗(yàn)(IHA)證實(shí),無豬囊尾蚴及其他寄生蟲感染。

1.1.2 主要試劑 MMP-9免疫組化試劑盒購自北京中杉生物技術(shù)有限公司,其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)蟲體的來源及蟲卵懸液的制備 豬帶絳蟲成蟲,采自四川省雅江縣呷拉鄉(xiāng)豬帶絳蟲病患者,口服檳榔-南瓜子驅(qū)蟲[3],新鮮蟲體用9 g/L生理鹽水浸泡保存。蟲體孕節(jié)及頭節(jié)用卡紅染色,制作壓片,經(jīng)顯微鏡觀察證實(shí)為豬帶絳蟲成蟲。挑開豬帶絳蟲后段全部孕節(jié)的子宮,用生理鹽水沖洗子宮數(shù)次使蟲卵溢出,收集全部沖洗液,3 000 r/min離心15 min,收集沉淀的蟲卵。取蟲卵懸液1 mL進(jìn)行膽汁孵育試驗(yàn),用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)六鉤蚴法[4]檢測(cè)蟲卵存活率為80%。取蟲卵懸液0.1 mL,光鏡下計(jì)數(shù)蟲卵(重復(fù)操作6次,取平均值),計(jì)算蟲卵總數(shù)。用生理鹽水稀釋蟲卵懸液濃度約10萬個(gè)/mL,其中的存活蟲卵數(shù)約為8萬/mL(10萬×80%)。

1.2.2 試驗(yàn)動(dòng)物感染 將每頭豬灌胃1 mL蟲卵(8萬個(gè)/mL)。乳豬以專用膨化顆粒飼料飼養(yǎng),隔離圈養(yǎng)于清潔水泥地面飼養(yǎng)宅內(nèi),防止自然感染。

1.2.3 免疫組化 在第40天、80天和120天各宰殺2頭豬。取含豬囊尾蚴的腦組織和肌肉組織1.0×1.0×0.5 cm3各數(shù)塊,置于100 mL/L福爾馬林中4℃冰箱過夜。常規(guī)脫水,石蠟包埋,4 μ m連續(xù)切片。部分切片行 HE染色,部分切片經(jīng)脫蠟、脫苯、水化后,置于pH 6.0枸櫞酸緩沖液中用高壓鍋進(jìn)行抗原修復(fù)2 min,PBS洗滌3次,分別滴加單克隆抗體MMP-9(1∶300),置于4℃冰箱內(nèi)過夜,PBS洗滌后滴加二抗孵育30 min,然后常規(guī)DAB顯色、蘇木素復(fù)染、封片。陰性對(duì)照用PBS液代替一抗。

1.2.4 數(shù)據(jù)測(cè)量及顯微攝影 將上述免疫組化切片每組隨機(jī)選取10張,每張切片在囊尾蚴囊壁及頭節(jié)隨機(jī)選取5個(gè)視場(chǎng),每個(gè)視場(chǎng)選取5個(gè)陽性表達(dá)區(qū)域用Mias圖像分析處理系統(tǒng)測(cè)量平均光密度(平均光密度為測(cè)量薄層斑點(diǎn)透射光強(qiáng)度大小,平均光密度值越大,標(biāo)本染色越淺)。光學(xué)顯微攝影裝置拍照。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化觀察

MMP-9陽性表達(dá)主要定位于豬囊尾蚴頭節(jié)及囊壁細(xì)胞的胞漿,呈棕黃色顆粒(圖1D、圖1E、圖1F、圖1G)。不同時(shí)期寄生在腦組織及肌肉組織的豬囊尾蚴均表達(dá)MMP-9,隨著感染時(shí)間增加,上述部位寄生的豬囊尾蚴MMP-9的表達(dá)均變化不大(P＞0.05),但寄生在腦組織的豬囊尾蚴MMP-9的表達(dá)略高于同期寄生在肌肉組織的豬囊尾蚴MMP-9的表達(dá)(P＜0.05)(表1)。

圖1 不同時(shí)期和寄生部位豬囊尾蚴MMP-9的表達(dá)及病理觀察Fig.1 Observation on the MMP-9 expression in Cysticercus cellulosae parasited in different tissues at different times on the pathological sections

表1 不同時(shí)期和寄生部位豬囊尾蚴M MP-9表達(dá)的平均光密度值Table 1 M MP-9 average value of optical density on Cysticercus cellulosae parasited in different tissues at different times

3 討論

豬帶絳蟲病是在世界范圍內(nèi)流行、危害人類健康的腸道蠕蟲病之一,而其幼蟲除了可寄生于中間宿主豬外,還可寄生于人體,引起嚴(yán)重的囊尾蚴病[5],不僅給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失,而且給人類健康帶來嚴(yán)重威脅。

腦囊尾蚴病是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的寄生蟲病,常伴隨血腦屏障的破壞,導(dǎo)致較高的發(fā)病率和死亡率[6]。研究小鼠腦囊尾蚴病模型發(fā)現(xiàn),血腦屏障和血腦脊液屏障的破壞與下列因素有關(guān):如血管床結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、血源性白細(xì)胞的積累、炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生和MMP-9的異常表達(dá)等有關(guān)[7-8]。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)是一類分解細(xì)胞外基質(zhì)的Zn2+依賴性蛋白酶家族,Ca2+存在的條件下作用更強(qiáng)?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(又稱明膠酶B)酶原相對(duì)分子質(zhì)量為92 ku,活性相對(duì)分子質(zhì)量83 ku,主要作用于明膠、Ⅳ、Ⅴ型膠原、彈性蛋白等[9]。Rosenberg G A等[10]免疫組化法研究顯示,MMP-9定位于神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞。MMP-9合成后以酶原pro-MMP-9的形式存在。正常腦組織中只有 pro-MMP-9,而無活性的 MMP-9。內(nèi)源性MMP-9來自星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞,外源性則來自內(nèi)皮細(xì)胞、滲出的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。MMP-9一旦激活,即可通過降解細(xì)胞外基質(zhì)成分,破壞血腦屏障完整性。

本研究結(jié)果顯示,不同時(shí)期寄生在腦組織及肌肉組織的豬囊尾蚴均表達(dá)MMP-9,隨著感染時(shí)間增加,上述部位寄生的豬囊尾蚴MMP-9的表達(dá)均變化不大(P＞0.05),但寄生在腦組織的豬囊尾蚴MMP-9的表達(dá)略高于寄生在肌肉組織的豬囊尾蚴MMP-9的表達(dá)(P＜0.05)。推測(cè)由于MMP-9降解Ⅳ型膠原和明膠,并具有降解彈性蛋白酶的活性,可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解,這種有效的溶組織作用促進(jìn)了早期囊尾蚴在宿主體內(nèi)的快速移行及隨后在宿主體內(nèi)的定植;此外,豬囊尾蚴蟲體成分或分泌排泄抗原可刺激機(jī)體組織細(xì)胞(如血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MMP)[11],加重了機(jī)體組織損傷,使蟲體到達(dá)寄生部位或異位寄生。由于大腦和肌肉的組織學(xué)特征不同,腦組織寄生的豬囊尾蚴MMP-9的表達(dá)略高于肌肉組織寄生的豬囊尾蚴MMP-9的表達(dá)。

在小鼠腦囊尾蚴病模型中,血腦屏障的破壞和白細(xì)胞從軟腦膜的遷移滲出在感染幾天后即可發(fā)生,而在腦實(shí)質(zhì)血管部位則需要5周[12]。在感染后1 d從軟腦膜血管處滲出的白細(xì)胞表達(dá)多種活性基質(zhì)金屬蛋白酶。這些發(fā)現(xiàn)表明,在感染早期滲出的白細(xì)胞需要表達(dá)多種基質(zhì)金屬蛋白酶,利用基質(zhì)金屬蛋白酶的活性穿過軟腦膜血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接復(fù)合體蛋白和血管基底膜復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu),通常這些結(jié)構(gòu)構(gòu)成保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的屏障。研究中分析的許多基質(zhì)金屬蛋白酶(如MMP-2、MMP-3、MMP-7和MMP-9)均具有降解連接復(fù)合體蛋白的作用。這些蛋白包括封閉蛋白(occluding)、水閘蛋白(claudin-5)、周膜蛋白 ZO1和 VE-鈣黏素等[13]。

本研究組織病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),感染40 d時(shí)寄生在腦組織的豬囊尾蚴周圍見少量炎癥細(xì)胞浸潤,以淋巴細(xì)胞為主,可見個(gè)別酸性粒細(xì)胞。感染80 d時(shí),豬囊尾蚴附近有大量炎性細(xì)胞浸潤,以淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞為主,可見部分酸性粒細(xì)胞(圖 1I)。感染120 d時(shí),豬囊尾蚴附近同樣有大量炎癥細(xì)胞浸潤,以不等量的淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞為主,可見個(gè)別多核巨細(xì)胞;部分囊壁側(cè)可見數(shù)層嗜酸性炎癥反應(yīng)。感染40 d時(shí)寄生在肌肉組織的豬囊尾蚴周圍以淋巴細(xì)胞,漿細(xì)胞浸潤為主,有少許酸性粒細(xì)胞分布,感染80 d和120 d時(shí),豬囊尾蚴周圍有少量慢性炎癥細(xì)胞浸潤,以淋巴細(xì)胞為主,見少量酸性粒細(xì)胞(圖1H)。推測(cè)豬囊尾蚴鄰近組織浸潤的多種白細(xì)胞,可表達(dá)多種活性基質(zhì)金屬蛋白酶,對(duì)早期豬囊尾蚴在宿主體內(nèi)的快速移行及隨后在宿主體內(nèi)的定植起到一定的促進(jìn)作用。

寄生蟲感染最嚴(yán)重的后果之一是引起腦部并發(fā)癥,而MMP在破壞血腦屏障復(fù)雜結(jié)構(gòu)的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此,針對(duì)一些可以導(dǎo)致腦部病變的寄生蟲感染,或許可以選擇調(diào)控MMP活性來控制疾病的進(jìn)一步發(fā)展惡化。這對(duì)豬囊蟲病,尤其是對(duì)人腦囊蟲病防控措施的制定具有一定研究意義。

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Analysis of Expression of Matrix Metalloproteinase-9 of Cysticercus cellulosae in Porcine Mascle and Brain

FANG Wen1,XIAO Liang-liang2,BAO Huai-en2,MOU Rong2

(1.Department of Clinical Laboratory Sciences,Guiyang Medical College,Guiyang,Guizhou,550004,China;2.Department of Parasitology,Guiyang Medical College,Guiyang,Guizhou,550004,China)

To analyse the expression of matrix metalloproteinase-9(MMP-9)inCysticercuscellulosaeby immunohistochemistry methods,six piglets of 20 days old were infected with a dose of 80 000 eggs ofTaenia sodium,and the test have been done on paraffin-embedded sections ofCysticercus cellulosaeacquired at 40,80 and 120 days after infection from muscle and brain.The results showed that there were MMP-9 expressing in the head and wall ofCysticercuscellulosaefrom different tissues at different times.As the time increases,the MMP-9 expression ofCysticercuscellulosaefrom different tissues were little changed(P＞0.05),the MMP-9 expression ofCysticercuscellulosaefrom the brain were slightly higher than that from the muscle(P＜0.05).T here was a slightly differences on MMP-9 expression inCysticercus cellulosaefrom different tissues because of the different histological features.

Cysticercus cellulosae;matrix metalloproteinase-9;immunohistochemistry

S786,S852.734

A

1007-5038(2011)07-0025-04

2011-02-28

國家自然科學(xué)基金(30660168)

方 文(1968-),女,四川崇州人,副教授,博士,主要從事病原生物蛋白質(zhì)組學(xué)研究。