硬溶質(zhì)型桃果實(shí)成熟過(guò)程中細(xì)胞壁多糖降解特性及其相關(guān)酶研究

闞 娟，劉 濤，金昌海,*，謝海艷

硬溶質(zhì)型桃果實(shí)成熟過(guò)程中細(xì)胞壁多糖降解特性及其相關(guān)酶研究

闞 娟1，劉 濤1，金昌海1,*，謝海艷2

(1.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127；2.揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 江蘇 揚(yáng)州 225009)

以硬溶質(zhì)型桃‘晚湖景’為試材，研究細(xì)胞壁多糖降解以及細(xì)胞壁多糖降解相關(guān)酶對(duì)硬溶質(zhì)型桃果實(shí)成熟軟化的影響。結(jié)果表明：硬溶質(zhì)型桃果實(shí)成熟過(guò)程中，CDTA-1果膠含量上升，兩種Na2CO3溶性果膠含量在成熟末期減少率分別為22.5%和27.4%。KOH溶性果膠含量在整個(gè)成熟過(guò)程中變化不明顯。果實(shí)CDTA、Na2CO3組分中果膠多糖主鏈的斷裂、半纖維素和纖維素組分中阿拉伯糖和半乳糖的降解主要發(fā)生在成熟末期；β-半乳糖苷酶(β-Gal)與桃果實(shí)成熟軟化啟動(dòng)密切相關(guān)，多聚半乳糖醛酸酶(PG)和纖維素酶(Cx)對(duì)桃果實(shí)成熟后期快速軟化起重要作用。Na2CO3-1溶性果膠多糖的降解與硬溶質(zhì)型果實(shí)采后軟化密切相關(guān)，KOH-1、KOH-2半纖維素多糖的降解可能促進(jìn)硬溶質(zhì)型桃果實(shí)成熟軟化進(jìn)程，富含半乳糖醛酸的果膠多糖主鏈的斷裂以及果膠、半纖維素、纖維素中阿拉伯糖、半乳糖等中性糖的降解都可能是果肉軟化的重要因素，并有多種多糖降解酶參與其中。

桃；成熟軟化；細(xì)胞壁多糖；單糖組成

桃果實(shí)成熟過(guò)程中果肉硬度下降可分為兩個(gè)階段，在成熟早期，果肉硬度不斷下降但很慢；在成熟的后期，果肉硬度下降很快，這一階段也被叫做“溶質(zhì)”階段[1]。桃根據(jù)果肉結(jié)構(gòu)常被分為兩大類：溶質(zhì)型桃和硬肉型桃(stony-hard-flesh)。而溶質(zhì)型桃又細(xì)分為軟溶質(zhì)型(melting-flesh)和硬溶質(zhì)型(non-melting-flesh)[2]。成熟的桃無(wú)論是軟溶質(zhì)型還是硬溶質(zhì)型在其成熟過(guò)程中都會(huì)產(chǎn)生乙烯。軟溶質(zhì)型桃的特點(diǎn)是成熟過(guò)程中乙烯大量釋放，果肉迅速軟化，而硬溶質(zhì)型桃的軟化過(guò)程會(huì)受到更多的限制，成熟過(guò)程中乙烯釋放一直很少，軟化過(guò)程緩慢，果肉堅(jiān)硬，直到后期在溶解的時(shí)候，才會(huì)通過(guò)不停的釋放乙烯來(lái)加速其軟化，有著很高的保鮮品質(zhì)，在市場(chǎng)上的流通時(shí)間和供貨期比普通的軟溶質(zhì)型水蜜桃明顯延長(zhǎng)。目前，對(duì)桃果實(shí)的研究主要集中在軟溶質(zhì)型桃果實(shí)，系統(tǒng)全面的研究硬溶質(zhì)型桃果實(shí)成熟過(guò)程中各細(xì)胞壁多糖組分的降解特性以及相關(guān)降解酶在桃果實(shí)軟化中的作用鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以硬溶質(zhì)型桃‘晚湖景’為試材，分析細(xì)胞壁多糖降解以及細(xì)胞壁多糖降解相關(guān)酶對(duì)硬溶質(zhì)型桃果實(shí)成熟軟化的影響，探討硬溶質(zhì)型桃果實(shí)成熟軟化的機(jī)理，為完善桃果實(shí)成熟軟化機(jī)理及延長(zhǎng)貯藏期的研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試桃品種為‘晚湖景’，采自無(wú)錫陽(yáng)山，分批采收后即刻運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室，剔除病果、傷果，選取大小相近的按成熟度不同分為四組。

成熟度Ⅰ：表示成熟前期，果皮顏色白綠，基部很硬；成熟度Ⅱ：表示開始成熟，果皮顏色黃帶微紅，基部很硬；成熟度Ⅲ：表示中等成熟，果皮顏色有二分之一左右為紅色，基部很硬；成熟度Ⅳ：表示完全成熟，果皮顏色全紅，基部較硬。

在采收當(dāng)天去掉果皮和果核，將果肉部分切成小塊，用液氮處理后裝在聚乙烯薄膜塑料袋中，并立即保存于-80℃超低溫冰箱中用于試驗(yàn)分析。

1.2 試劑與儀器

對(duì)硝基酚半乳糖苷、對(duì)硝基酚、多聚半乳糖醛酸、D-半乳糖醛酸 美國(guó)Sigma公司；鼠李糖、半乳糖醛酸、巖藻糖、CDTA 瑞士Fluka公司；阿拉伯糖 上海悅耳化學(xué)品有限公司；木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、肌醇為色譜純；甲醇為優(yōu)級(jí)純；氫氧化鉀、吡啶、三甲基氯硅烷、六甲基二硅胺烷、乙酰氯、乙醇、氯仿、正己烷、丙酮、無(wú)水碳酸鈉、氯化鈉、硫酸銨、醋酸鈉、硼氫化鈉等為分析純。

GY-1型果實(shí)硬度計(jì) 牡丹江市機(jī)械研究所；GC-14B型氣相色譜儀 日本島津公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海青浦滬西儀器廠；5804R型高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 果實(shí)硬度的測(cè)定

采用果實(shí)硬度計(jì)(測(cè)頭直徑為3.5mm)測(cè)定去除果皮后果肉的硬度。

1.4 乙烯釋放量的測(cè)定

參照J(rèn)in等[3]的方法。氣相色譜條件為：FID檢測(cè)器，SPB-1毛細(xì)管柱(0.25mm×30m，0.25μm)，載氣為N2，柱溫40℃，檢測(cè)器溫度120℃，重復(fù)3次。

1.5 果實(shí)細(xì)胞壁物質(zhì)(cell wall materials，CWM)提取

參照Rose等[4]的方法進(jìn)行。

1.6 果實(shí)細(xì)胞壁多糖的分步提取

參照Brett等[5]和金昌海等[6]的方法。稱取上步所得CWM 0.5g，依次用50mL 50mmol/L pH6.5環(huán)己二胺四乙酸(CDTA)于20℃振蕩提取5、2h；50mL 50mmol/L Na2CO3(含20mmol/L NaBH4)溶液1℃通N2振蕩提取20h，20℃通N2振蕩提取2h，0.5、1.0、4.0mol/L KOH(含20mmol/L NaBH4) 20℃通N2振蕩提取2h。每步所得混和物 4℃離心分離，上清液過(guò)濾，濾渣加入沉淀，沉淀用蒸餾水洗1次，水洗液加入上清中。上清液和最終所得不溶物(CWM-殘?jiān)? 4℃透析充分(透析袋分子質(zhì)量截留值3500D)。35℃減壓濃縮，凍干，稱質(zhì)量，分別得CDTA-1、CDTA-2、Na2CO3-1、Na2CO3-2、KOH-1、KOH-2、KOH-3、CWM-殘?jiān)?種細(xì)胞壁多糖物質(zhì)。每樣重復(fù)3次，結(jié)果用平均值表示。所提多糖樣品真空干燥保存待分析。

1.7 細(xì)胞壁多糖中單糖組成色譜分析

參照J(rèn)in等[3]方法，采用GC-14B氣相色譜儀，OV-1氣相色譜柱(30m×0.25mm，0.33μm)，F(xiàn)ID檢測(cè)器。載氣N2，氫氣流量60mL/min，進(jìn)樣量1μL，檢測(cè)器及進(jìn)樣溫度250℃。柱溫采用程序式升溫：起始柱溫150℃，保持1min，10℃/min升至200℃，保持10min，5℃/min升至220℃，保持10min，5℃/min升至240℃，保持1min。用肌醇作為內(nèi)標(biāo)物。

1.8 酶活性測(cè)定

多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)活性測(cè)定：參照Huber等[7]方法；果膠甲酯酶(pectin methylesterase，PME)活性測(cè)定：參照Hagerman等[8]方法；纖維素酶活性測(cè)定：參照Xu等[9]方法；β-半乳糖苷酶(β-Gal)活性測(cè)定：參照金昌海等[6]方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃果實(shí)成熟過(guò)程中硬度和乙烯釋放量的變化

果實(shí)硬度是反映果實(shí)質(zhì)地的一個(gè)重要指標(biāo)，也是反映果實(shí)成熟衰老的重要指標(biāo)之一。如圖1所示，硬溶質(zhì)型桃果實(shí)在成熟前期硬度下降不明顯，一直保持較高的硬度，到成熟度Ⅳ時(shí)迅速下降。表明硬溶質(zhì)型桃硬度下降只出現(xiàn)在成熟末期。軟溶質(zhì)型桃果實(shí)在成熟中期硬度就開始迅速下降[10]。可以看出，硬溶質(zhì)型與軟溶質(zhì)型桃果實(shí)相比，成熟過(guò)程中硬度有更長(zhǎng)的保持期。

圖1 桃果實(shí)成熟過(guò)程中硬度的變化Fig.1 Change in firmness during maturation of peach fruit

如圖2所示，硬溶質(zhì)型桃果實(shí)成熟過(guò)程中，成熟前期乙烯釋放量很低，成熟度Ⅲ乙烯釋放開始增加，到成熟度Ⅳ時(shí)乙烯釋放顯著增加，是成熟度Ⅱ乙烯釋放量的14倍，乙烯釋放量最高。硬溶質(zhì)型桃果實(shí)同一時(shí)期乙烯釋放量明顯低于軟溶質(zhì)型[10]，到成熟末期才有大量釋放，而且乙烯釋放高峰明顯推遲。

圖2 桃果實(shí)成熟過(guò)程中乙烯釋放量的變化Fig.2 Change in ethylene production during maturation of peach fruit

2.2 桃果實(shí)成熟過(guò)程中細(xì)胞壁多糖組分含量的變化

表1 桃果實(shí)成熟過(guò)程中細(xì)胞壁多糖組分含量的變化Table 1 Quantitative changes in various cell wall polysaccharides during maturation of peach fruit mg/100g

由表1可以看出，硬溶質(zhì)型桃果實(shí)樹體成熟過(guò)程中CDTA-1和CDTA-2溶性果膠多糖都逐漸增大。兩種Na2CO3溶性果膠含量在成熟末期下降明顯，減少率為22.5%和27.4%。KOH溶性果膠含量在整個(gè)成熟過(guò)程中變化不明顯。由此看出，硬溶質(zhì)型桃果實(shí)的軟化特性與Na2CO3溶性果膠多糖等細(xì)胞壁多糖組分的降解密切相關(guān)。對(duì)軟溶質(zhì)型桃果實(shí)的研究發(fā)現(xiàn)[11]，除了兩種Na2CO3溶性果膠含量下降明顯外，KOH-1、KOH-2、CWM-殘?jiān)冉M分含量在果實(shí)成熟軟化過(guò)程中也逐漸下降。

2.3 桃果實(shí)成熟過(guò)程中CDTA溶性果膠中單糖組成的變化

用50mmol/L CDTA提取的兩種螯合劑溶性果膠主要為離子結(jié)合型果膠，20℃提取溫度有利于最大限度地減少果膠在提取過(guò)程中的降解。CDTA-1組分主要為以Ca2+鉸鏈的半乳糖醛酸聚糖主鏈，主鏈上間隔插入單個(gè)鼠李糖殘基。而用CDTA溶液提取5h后，再在相同條件下提取2h所得的CDTA-2組分中還含有富含羥脯氨酸的糖蛋白。由表2可以看出，構(gòu)成CDTA-1和CDTA-2溶性果膠多糖組分的單糖中半乳糖醛酸的含量明顯高于其他單糖，且在成熟過(guò)程中發(fā)生了明顯的降解。CDTA-1組分中半乳糖醛酸與鼠李糖含量比值由成熟度Ⅰ的17.18、成熟度Ⅱ的20.06、成熟度Ⅲ的17.5下降到成熟度Ⅳ的7.05，該比值在CDTA-2組分中由成熟度Ⅰ的11.98、成熟度Ⅱ的10.96下降至成熟度Ⅲ的7.63、成熟度Ⅳ6.88，說(shuō)明在硬溶質(zhì)型桃果實(shí)中，兩種CDTA溶性果膠多糖中主鏈半乳糖醛酸的降解主要發(fā)生在成熟后期，而軟溶質(zhì)型桃果實(shí)成熟前期才是果膠主鏈半乳糖醛酸的快速下降時(shí)期[11]。衡量果膠多糖主鏈變化指標(biāo)，即半乳糖醛酸與鼠李糖含量比值在CDTA-1、CDTA-2中隨著果實(shí)硬度的下降而迅速下降。

構(gòu)成細(xì)胞壁果膠多糖主鏈的半乳糖醛酸聚糖(homogalacturonan，HGA)是由半乳糖醛酸組成，鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅰ(rhamnogalacturonanI，RG-Ⅰ)是由半乳糖醛酸和鼠李糖組成，阿拉伯糖、半乳糖是構(gòu)成RG-Ⅰ側(cè)鏈的主要成分。分析結(jié)果表明，桃果實(shí)CDTA溶性果膠多糖組分中富含HGA主鏈和少量帶有阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯聚糖和半乳聚糖等側(cè)鏈成分的RG-Ⅰ，說(shuō)明桃果實(shí)細(xì)胞壁中多聚半乳糖醛酸與富含阿拉伯聚糖、半乳聚糖、阿拉伯半乳聚糖支鏈的鼠李糖半乳聚糖相互交聯(lián)在一起[12-13]。果膠內(nèi)半乳糖糖醛酸的支鏈富含阿拉伯糖、半乳糖。它們的解離，會(huì)分別導(dǎo)致阿拉伯糖與鼠李糖含量的比值、半乳糖與鼠李糖含量的比值的下降。 CDTA-1組分中阿拉伯糖與鼠李糖的比值由成熟度Ⅰ的7.82下降到成熟度Ⅳ的5.38。半乳糖與鼠李糖的比值由成熟度Ⅰ的13.59下降至成熟度Ⅳ的5.25。成熟末期支鏈阿拉伯糖和半乳糖都發(fā)生了明顯的降解。CDTA-2組分中阿拉伯糖與鼠李糖的比值成熟度Ⅰ和成熟度Ⅳ分別為6.6和6.2，降解不明顯。半乳糖與鼠李糖的比值由成熟度Ⅰ的10.37下降至成熟度Ⅳ的6.03。由此可見(jiàn)，在硬溶質(zhì)型桃果實(shí)樹體成熟后期CDTA溶性果膠中主鏈半乳糖醛酸，支鏈阿拉伯糖、半乳糖發(fā)生了明顯的降解，明顯滯后于軟溶質(zhì)型桃果實(shí)[11]。衡量果膠支鏈變化的指標(biāo)，半乳糖與鼠李糖含量的比值以及阿拉伯糖與鼠李糖含量的比值在CDTA-1、CDTA-2組分中的下降也說(shuō)明了果膠中半乳糖、阿拉伯糖這兩種支鏈中性糖的降解與硬溶質(zhì)型桃果實(shí)的成熟軟化密切相關(guān)。

表2 桃果實(shí)成熟過(guò)程中CDTA溶性果膠多糖的單糖組分摩爾分?jǐn)?shù)變化Table 2 Changes in monopolysaccharide composition of CDTA fractions during maturation of peach fruit %

2.4 桃果實(shí)成熟過(guò)程中Na2CO3溶性果膠中單糖組成的變化

用50mmol/L Na2CO3(含20mmol/L NaBH4)在不同溫度下提取的多糖成分，主要為共價(jià)結(jié)合型果膠鼠李半乳糖醛酸聚糖，先在1℃條件提取該果膠，有利于消除以后堿提取操作中由β-消去而發(fā)生的多糖解聚。由表3可以看出，Na2CO3溶性果膠成分中含有大量半乳糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖等果膠特性單糖成分，證明了該果膠半乳糖醛酸和鼠李糖構(gòu)成的主鏈上連接有富含阿拉伯糖、半乳糖的支鏈[12-13]。Na2CO3溶性果膠多糖成分的單糖類中半乳糖醛酸摩爾分?jǐn)?shù)相對(duì)于CDTA溶性果膠多糖明顯減少，阿拉伯糖和半乳糖摩爾分?jǐn)?shù)較高，表明桃果實(shí)Na2CO3溶性果膠多糖成分有別于CDTA溶性果膠多糖，其多糖組分中富含RG-Ⅰ主鏈成分，并帶有阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯聚糖和半乳聚糖等側(cè)鏈，構(gòu)成了結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的果膠多糖。硬溶質(zhì)型桃果實(shí)Na2CO3-1組分中，果膠鼠李半乳糖醛酸聚糖主鏈在成熟后期迅速降解，而軟溶質(zhì)型桃果實(shí)果膠鼠李半乳糖醛酸聚糖主鏈主要發(fā)生在前期[11]。支鏈半乳糖與鼠李糖含量的比值由成熟度Ⅰ的10.36迅速降至成熟度Ⅳ的8.68，在果實(shí)成熟前期變化不明顯。半乳糖醛酸與鼠李糖含量比值在Na2CO3-1中隨著果實(shí)硬度的下降而迅速下降。在Na2CO3-2組分中，果膠支鏈阿拉伯糖降解最為明顯，成熟度Ⅰ阿拉伯糖與鼠李糖含量比值為7.57，成熟度Ⅳ該比值為5.17，說(shuō)明該組分中阿拉伯糖的降解主要發(fā)生在果實(shí)樹體成熟后期，這與軟溶質(zhì)型桃果實(shí)相似[11]。

表3 桃果實(shí)成熟過(guò)程中Na2CO3溶性果膠多糖的單糖組分摩爾分?jǐn)?shù)變化Table 3 Changes in monopolysaccharide composition of Na2CO3soluble fractions during maturation of peach fruit%

2.5 桃果實(shí)成熟過(guò)程中KOH溶性半纖維素中單糖組成的變化

KOH-1、KOH-2主要為與細(xì)胞壁結(jié)合疏松的半纖維素多糖，KOH-3主要為與細(xì)胞壁結(jié)合緊密的半纖維素多糖。由表4可以看出，桃果實(shí)KOH溶性多糖組分中最顯著的特點(diǎn)就是木糖和葡萄糖等半纖維特征性單糖的摩爾分?jǐn)?shù)相對(duì)于CDTA、Na2CO3溶性果膠多糖明顯增多，同時(shí)阿拉伯糖和半乳糖的摩爾分?jǐn)?shù)也較高，而半乳糖醛酸的摩爾分?jǐn)?shù)卻明顯減少。說(shuō)明KOH溶性多糖組分中富含以木葡聚糖為主鏈的半纖維素多糖成分，而且由一定量的果膠嵌入半纖維素中形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，這種交聯(lián)是RG-Ⅰ主鏈通過(guò)側(cè)鏈相聯(lián)系而形成骨架[14]。在硬溶質(zhì)型桃果實(shí)樹體成熟過(guò)程中，KOH溶性多糖組分組成側(cè)鏈的阿拉伯糖和半乳糖的摩爾分?jǐn)?shù)逐漸減少。

KOH-1組分中，阿拉伯糖的摩爾分?jǐn)?shù)由成熟度Ⅰ的14.10%逐漸下降至成熟度Ⅳ的11.02%，半乳糖的摩爾分?jǐn)?shù)下降不明顯。KOH-2組分中，阿拉伯糖的摩爾分?jǐn)?shù)從成熟度Ⅰ的6.90%、成熟度Ⅱ的7.34%、成熟度Ⅲ的7.01%下降至成熟度Ⅳ的4.89%，半乳糖摩爾分?jǐn)?shù)也由成熟度Ⅰ的25.05%逐漸下降至成熟度Ⅳ的24.46%。KOH-3組分中，阿拉伯糖和半乳糖摩爾分?jǐn)?shù)在成熟后期也明顯下降。與硬溶質(zhì)型桃果實(shí)不同，軟溶質(zhì)型桃果實(shí)半乳糖的降解只發(fā)生在與細(xì)胞壁連接松散的半纖維素多糖中，在緊密連接的半纖維素多糖中未發(fā)生降解[11]。主鏈木葡聚糖成分中木糖和葡萄糖的摩爾分?jǐn)?shù)沒(méi)有減少，可見(jiàn)桃果實(shí)樹體成熟過(guò)程中KOH溶性多糖組分摩爾分?jǐn)?shù)的減少受木葡聚糖側(cè)鏈或存在于KOH溶性多糖組分中果膠多糖側(cè)鏈結(jié)構(gòu)變化的影響，半纖維素多糖組分中阿拉伯糖、半乳糖等中性糖的降解與果肉的軟化有密切的聯(lián)系。

表4 桃果實(shí)成熟過(guò)程中KOH溶性半纖維素多糖的單糖組分摩爾分?jǐn)?shù)變化Table 4 Changes in monopolysaccharide composition of KOH soluble fractions during maturation of peach fruit%

2.6 桃果實(shí)成熟過(guò)程中CMW-殘?jiān)袉翁墙M成的變化

CWM-殘?jiān)鼮镵OH不溶物，主要成分為纖維素，由表5可以看出，CMW-殘?jiān)嗵墙M分中含有大量的阿拉伯糖和半乳糖成分，可能是桃果實(shí)細(xì)胞壁多糖中果膠多糖能緊密結(jié)合到纖維素上，或者是這些多糖鏈比較復(fù)雜，物理結(jié)構(gòu)上相互纏繞，因此不為高濃度的KOH降解。果膠通過(guò)RG-Ⅰ的阿拉伯糖和半乳糖側(cè)鏈錨定在細(xì)胞壁上，或者通過(guò)共價(jià)鍵連接到基質(zhì)多糖-纖維素網(wǎng)絡(luò)，氫鍵連接到纖維素[14]，或者通過(guò)物理纏繞結(jié)合到其他細(xì)胞壁多聚體。Redgwell等[15]選取8個(gè)不同物種的KOH提取后的殘?jiān)?，加入從番茄中純化的?nèi)切PG酶，從中釋放出一半的阿拉伯糖，說(shuō)明一定比例的果膠關(guān)聯(lián)到纖維素，并不是通過(guò)側(cè)鏈，而是通過(guò)多聚半乳糖醛酸骨架。阿拉伯糖的摩爾分?jǐn)?shù)從成熟度Ⅲ的22.06%下降至成熟度Ⅳ的16.70%，半乳糖摩爾分?jǐn)?shù)從成熟度Ⅲ的37.04%下降至成熟度Ⅳ的32.91%，在硬溶質(zhì)型桃果實(shí)成熟后期阿拉伯糖和半乳糖顯著減少。軟溶質(zhì)型桃果實(shí)中主要是半乳糖的解離，且主要發(fā)生在成熟前期[11]。

表5 桃果實(shí)成熟過(guò)程中CMW-殘?jiān)w維素多糖的單糖組分摩爾分?jǐn)?shù)變化Table 5 Changes in monopolysaccharide composition of CMW-residue fractions during maturation of peach fruit %

2.7 桃果實(shí)成熟過(guò)程中PG、PME、纖維素酶和β-半乳糖苷酶活性的變化

PG能夠水解切開α-(1,4)半乳糖糖苷鍵，斷裂多聚半乳糖醛酸鏈，將果實(shí)細(xì)胞壁中多聚半乳糖醛酸降解為寡聚半乳糖醛酸和半乳糖醛酸，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)解體，導(dǎo)致果實(shí)軟化。如圖3所示，在硬溶質(zhì)型桃果實(shí)成熟過(guò)程中，成熟前期PG活性很低，隨著果實(shí)硬度下降和乙烯釋放量的增加，PG活性逐漸增加，在成熟度Ⅳ時(shí)PG活性達(dá)到最高值為1.37mg/(g·h)。與軟溶質(zhì)型桃果實(shí)相似[10]，PG活性高峰都出現(xiàn)在成熟后期，表明該酶對(duì)桃果實(shí)成熟后期快速軟化起重要作用，只是硬溶質(zhì)型桃果實(shí)中PG活性高峰來(lái)的更遲。

PME能夠去除多聚半乳糖醛酸的半乳糖醛酸殘基的C6酯化基團(tuán)，催化果膠酯酸轉(zhuǎn)化為果膠酸，以利于PG發(fā)揮其生理作用。如圖3所示，PME活性在整個(gè)成熟過(guò)程中呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，成熟前期，PME活性很低，隨著果實(shí)成熟，PME活性逐漸增大，同PG活性表現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)。在PME的作用下，果膠甲酯化程度降低，更有利于PG對(duì)果膠的水解作用。PME在軟溶質(zhì)型桃果實(shí)中比硬溶質(zhì)型更早的發(fā)揮作用[16]。

纖維素酶是在細(xì)胞壁降解過(guò)程中起重要作用的一種細(xì)胞壁酶，能夠分解含β-(1,4)糖苷鍵的半纖維素，但并不作用于水溶性纖維素。纖維素酶使纖維素降解，從而導(dǎo)致細(xì)胞壁纖維素微纖絲-半纖維素-果膠質(zhì)“經(jīng)緯結(jié)構(gòu)”的松散。果膠酶趁機(jī)分解果膠質(zhì)，導(dǎo)致果實(shí)成熟軟化過(guò)程的進(jìn)行。由圖3可以看出，在硬溶質(zhì)型桃果實(shí)成熟前期，纖維素酶活性變化不明顯，都保持在3.6mg/(g·h)左右，直到成熟后期，活性才突然增加至5.3mg/(g·h)。由此看出，纖維素酶在硬溶質(zhì)型桃果實(shí)前期軟化中的作用不明顯，主要在后期起作用。

β-Gal作用于鼠李半乳聚糖骨架的支鏈殘基，降解果膠聚合體，破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，從而使果實(shí)軟化。如圖3所示，硬溶質(zhì)型桃果實(shí)β-Gal活性在成熟前期迅速上升，在成熟度Ⅲ達(dá)到最大值，隨后又逐漸降低。軟溶質(zhì)型桃果實(shí)β-Gal活性在成熟Ⅰ最高，比硬溶質(zhì)型桃果實(shí)更提前發(fā)揮作用[10]。由β-Gal在成熟前期到中期時(shí)活性的快速增加可以看出，β-Gal不僅與桃果實(shí)成熟軟化密切相關(guān)，而且其對(duì)桃果實(shí)軟化的作用不同于PG，它主要與桃果實(shí)成熟前期的果實(shí)軟化啟動(dòng)相關(guān)。

圖3 桃果實(shí)成熟過(guò)程中細(xì)胞壁降解相關(guān)酶活性的變化Fig.3 Changes in the activities of several enzymes related to cell wall degradation during maturation of peach fruit

3 討 論

果實(shí)硬度是反映果實(shí)軟化的重要外在指標(biāo)。果實(shí)成熟時(shí)最顯著的變化特征就是果肉硬度的變化。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，硬溶質(zhì)型桃果實(shí)在樹體成熟過(guò)程中，硬度下降只出現(xiàn)在成熟末期，前期一直保持較高的硬度(圖1)，軟溶質(zhì)型桃果實(shí)在成熟中期硬度就開始迅速下降[10]。硬溶質(zhì)型與軟溶質(zhì)型桃果實(shí)相比，成熟過(guò)程中硬度有更長(zhǎng)的保持期，更利于采后貯藏，延長(zhǎng)貨架期。

乙烯誘導(dǎo)了果實(shí)的成熟，所以要控制果實(shí)成熟必須要控制乙烯的生成[17]。與軟溶質(zhì)型桃果實(shí)相比[10]，硬溶質(zhì)型桃果實(shí)同一時(shí)期乙烯釋放量明顯低于軟溶質(zhì)型，到成熟末期才有大量釋放，而且乙烯釋放高峰明顯推遲。說(shuō)明硬溶質(zhì)型桃果實(shí)更利于采后貯藏的特性與其生理生化變化密切相關(guān)。

高等植物細(xì)胞壁的共同特征是均由纖維素、半纖維素、果膠物質(zhì)和糖蛋白等大分子組成。Trainotti等[18]對(duì)桃果實(shí)細(xì)胞壁基因組表達(dá)的分析結(jié)果表明桃果實(shí)的軟化過(guò)程極為復(fù)雜，有許多酶類參與其中。果實(shí)成熟軟化過(guò)程中，在各種酶的作用下，溶解度較低的高分子質(zhì)量細(xì)胞壁多糖發(fā)生降解或解聚，使得大分子長(zhǎng)鏈多糖的含量減少，溶解度較大的小分子質(zhì)量組分含量增多，從而造成果實(shí)細(xì)胞壁 CDTA組分含量增多，與芒果[19]、甜瓜[20]等水果成熟過(guò)程中CDTA溶性果膠含量增加結(jié)果相一致，而其他多糖組分摩爾分?jǐn)?shù)逐漸減少[21](表1)。由單糖成分分析結(jié)果推測(cè)，衡量果膠多糖主鏈變化指標(biāo)，即半乳糖醛酸與鼠李糖含量比值在CDTA-1、CDTA-2、Na2CO3-1中隨著果實(shí)硬度的下降而迅速下降(表2、3)。說(shuō)明桃果實(shí)樹體成熟過(guò)程中，尤其在成熟后期，富含半乳糖醛酸的果膠主鏈發(fā)生了斷裂。研究表明，甜瓜[20]等果實(shí)的成熟軟化過(guò)程中細(xì)胞壁半纖維素多糖的變化與果實(shí)的成熟軟化有緊密的聯(lián)系。半乳糖含量在KOH-2、KOH-3、CWM-殘?jiān)M分中，阿拉伯糖含量在KOH-1、KOH-2、KOH-3、CWM-殘?jiān)M分中的下降，說(shuō)明了硬溶質(zhì)型桃果實(shí)細(xì)胞壁半纖維素、纖維素多糖組分中這兩種支鏈中性糖的解離可能是多糖解聚、果實(shí)變軟的原因之一。因此看出，桃果實(shí)成熟軟化過(guò)程中細(xì)胞壁多糖的變化非常復(fù)雜，富含半乳糖醛酸的果膠多糖主鏈的斷裂以及果膠、半纖維素、纖維素中阿拉伯糖、半乳糖等中性糖的降解都可能是果肉軟化的重要因素，并有多種多糖降解酶參與其中。

硬溶質(zhì)型桃果實(shí)樹體成熟過(guò)程中，果實(shí)CDTA、Na2CO3組分中果膠多糖主鏈的斷裂(表2、3)、半纖維素和纖維素組分中阿拉伯糖和半乳糖的降解主要發(fā)生在成熟末期(表4、5)，而軟溶質(zhì)型桃果實(shí)多糖主鏈斷裂和支鏈降解主要發(fā)生在成熟中后期[11]，說(shuō)明細(xì)胞壁多糖的降解與各類型桃果實(shí)的軟化進(jìn)程密切相關(guān)。硬溶質(zhì)型桃果實(shí)成熟過(guò)程中KOH-1、KOH-2組分中組成側(cè)鏈的阿拉伯糖逐漸下降，半乳糖下降不明顯。KOH-3組分中，阿拉伯糖和半乳糖含量在成熟后期也明顯下降(表4)。而軟溶質(zhì)型桃果實(shí)半乳糖的降解只發(fā)生在與細(xì)胞壁連接松散的半纖維素多糖中，在緊密連接的半纖維素多糖中未發(fā)生降解[11]。CMW-殘?jiān)M分在硬溶質(zhì)型桃果實(shí)成熟后期阿拉伯糖和半乳糖顯著減少，軟溶質(zhì)型桃果實(shí)CMW-殘?jiān)M分中主要是半乳糖的解離，且解離主要發(fā)生在成熟前期[11]。這可能跟果實(shí)品種細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的差異性和果實(shí)成熟過(guò)程中細(xì)胞壁多糖降解相關(guān)酶在不同品種間發(fā)揮功效的時(shí)間和作用不盡相同有關(guān)。

對(duì)果實(shí)成熟過(guò)程中多種細(xì)胞壁降解酶編碼基因表達(dá)水平變化的研究表明，果實(shí)的成熟軟化與多種多糖降解酶活性密切相關(guān)[22]。PG在果實(shí)軟化中主要作用于富含半乳糖醛酸的多糖主鏈，是細(xì)胞壁多糖主鏈斷裂的重要作用酶，有關(guān)PG在果肉軟化中的重要作用已在許多果實(shí)中得以證明，在桃果實(shí)樹體成熟過(guò)程中能造成長(zhǎng)而細(xì)的果膠多聚體解聚，成為短而粗的多聚體。PME能夠去除多聚半乳糖醛酸的半乳糖醛酸殘基的C6酯化基團(tuán)，催化果膠酯酸轉(zhuǎn)化為果膠酸，以利于PG發(fā)揮其生理作用。纖維素酶能夠分解含β-(1,4)糖苷鍵的半纖維素。β-Gal能切除多糖側(cè)鏈中非還原末端半乳糖殘基，可造成細(xì)胞壁多糖中半乳糖、阿拉伯糖含量的降低，阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯苷露聚糖等多聚物的解聚。在蘋果果實(shí)成熟前期β-Gal活性較低，完熟后達(dá)到最高，但是在整個(gè)生長(zhǎng)成熟過(guò)程中β-Gal總的活性沒(méi)有變化[23]。本實(shí)驗(yàn)研究表明，β-Gal作用下的支鏈半乳糖的降解則可能與果實(shí)成熟軟化啟動(dòng)密切相關(guān)(圖3)。硬溶質(zhì)型桃果實(shí)樹體成熟過(guò)程中PG及其起輔助作用的PME變化趨勢(shì)大致相同，活性都在成熟后期達(dá)到最大(圖3)，纖維素酶也在成熟后期活性增大(圖3)。PG和纖維素酶對(duì)桃果實(shí)成熟后期快速軟化起重要作用。PG、PME、纖維素酶和β-Gal都是硬溶質(zhì)型桃果實(shí)成熟軟化的重要作用酶，分別在果實(shí)成熟的不同階段起作用。研究發(fā)現(xiàn)，與硬溶質(zhì)型相比，細(xì)胞壁多糖降解相關(guān)酶活性高峰更早的在軟溶質(zhì)型桃果實(shí)中表現(xiàn)出來(lái)，這可能是導(dǎo)致軟溶質(zhì)型桃果實(shí)在樹體成熟過(guò)程中更容易軟化的原因之一。

桃果實(shí)的成熟軟化受到多種內(nèi)外因素的影響，乙烯的積累與多糖降解相關(guān)酶的表達(dá)以及對(duì)酶蛋白激活的作用都有待于進(jìn)一步的證實(shí)。為此，可以采用分子生物學(xué)手段進(jìn)一步研究乙烯的生物合成與細(xì)胞壁多糖降解酶以及它們之間的相互關(guān)系對(duì)桃果實(shí)成熟軟化的作用。

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Degradation of Cell Wall Polysaccharides and Related Enzyme Activities during Non-melting-flesh Peach Fruit Softening

KAN Juan1，LIU Tao1，JIN Chang-hai1,*，XIE Hai-yan2
(1. College of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China；2. College of Bioscience and Biotechnology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)

As a representative of non-melting-flesh peach, Wanhujing peach cultivar was used to investigate the degradation of cell wall polysaccharides in non-melting-flesh peach during its softening and the activities of related enzymes. During peach fruit ripening, CDTA-1 pectin content increased, and the contents of two kinds of Na2CO3 soluble pectin were decreased by 22.5% and 27.4% until the late stage. KOH soluble pectin content did not change significantly throughout the ripening process. The degradation of pectin main chains in CDTA and Na2CO3and the loss of arabinosyl and galactosyl from pectin side chains in cellulosic polysaccharides mainly happened at the end of the ripening process. β-galactosidase was associated with the startup of peach fruit softening. Polygalacturonase and Cx-Cellulase were important enzymes that contributed to the end of peach fruit softening. Na2CO3-1 pectin was an important factor affecting non-melting-flesh peach fruits softening. The degradation of KOH-1 and KOH-2 fractions may promote peach fruit softening. The fracture of pectin chain rich in galacturonic, as well as the degradation of neutral sugars such as arabinose and galactose in pectin, hemicellulos and cellulose, and a variety of polysaccharides degrading enzyme were likely to be important factors affecting non-melting-flesh peach fruit softening.

peach；ripening and softening；cell wall polysaccharides；monopolysaccharide composition

TS255.3；S662.1

A

1002-6630(2011)04-0268-07

2010-05-25

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30840016)；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK2010310)；

江蘇省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目(10KJB550004)

闞娟(1980—)，女，講師，博士研究生，研究方向果蔬采后生理與分子生物學(xué)。E-mail：kanjuan@yzu.edu.cn

*通信作者：金昌海(1963—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)楣卟珊笊砼c分子生物學(xué)。E-mail：chjin@yzu.edu.cn