甲拌磷殘留檢測間接競爭ELISA試劑盒的研制

魏松紅，逄若霖，王 翀，紀(jì)明山，谷祖敏，祁之秋，王英姿

甲拌磷殘留檢測間接競爭ELISA試劑盒的研制

魏松紅，逄若霖，王 翀，紀(jì)明山，谷祖敏，祁之秋，王英姿

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

研制用于檢測甲拌磷殘留量的間接競爭ELISA試劑盒。甲拌磷包被抗原的最佳工作質(zhì)量濃度為4mg/L，抗體的最佳稀釋倍數(shù)為8000，甲拌磷多克隆抗體交叉反應(yīng)率小于20%，甲拌磷抑制率回歸曲線為y=18.846x＋6.9949，在1～5000μg/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢測限為4.90μg/L，IC50為191.37μg/L。甲拌磷試劑盒的添加回收率均高于75%，供試樣品檢測結(jié)果的批內(nèi)和批間變異系數(shù)均低于10%。試劑盒在4℃或-20℃下有效期為270d。

甲拌磷；殘留；酶聯(lián)免疫吸附測定法；試劑盒

甲拌磷[phorate，O,O-二乙基-S-(乙硫基甲基)二硫代磷酸酯]是有機(jī)磷類重要的內(nèi)吸性殺蟲殺螨劑，主要用于防治棉花、水稻、小麥、高粱等大田作物上的害蟲[1]，為土壤和種子處理劑，高等毒性。甲拌磷在植物體內(nèi)氧化為更高毒性的氧化物，并有較長的殘效期，對人類的健康存在潛在威脅。因此，對甲拌磷殘留快速有效的檢測方法研究具有一定意義。目前，常見的甲拌磷檢測方法為氣質(zhì)聯(lián)用法和液質(zhì)聯(lián)用法[2-3]，由于常規(guī)儀器分析方法前處理步驟復(fù)雜，費時費力、設(shè)備昂貴，需要專業(yè)人員操作，不適宜大量樣品和現(xiàn)場快速檢測。以免疫化學(xué)為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫吸附分析(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)檢測方法，具有快速、簡便、靈敏、經(jīng)濟(jì)的特點，適合大批量樣品的檢測[4]。Jeffre等[5]利用O,O-二乙基-O-[對-(4-羧基丁基)苯基]硫代磷酸酯作為半抗原制得廣譜特異性抗體，采用酶聯(lián)免疫方法對有機(jī)磷類殺蟲劑進(jìn)行檢測。劉賢進(jìn)等[6]采用二乙基膦酸乙酸做為通用結(jié)構(gòu)半抗原制備抗血清，對毒死蜱、辛硫磷等12種常見有機(jī)磷農(nóng)藥具有特異性，IC50為0.12～3.8μg/mL。本實驗在甲拌磷自主合成人工抗原及制備多克隆抗體的研究基礎(chǔ)上[7]，研制甲拌磷間接競爭ELISA試劑盒，并對其性能進(jìn)行測定，適用于土壤、糧食等樣品中甲拌磷殘留的分析。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

甲拌磷多克隆抗體 本實驗室制備；96孔酶標(biāo)版JET公司；五硫化二磷 河北世紀(jì)農(nóng)藥有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG 中杉金橋有限公司；鄰苯二胺(OPD) 中國五聯(lián)化工廠；0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)；洗滌液：含體積分?jǐn)?shù)0.05%吐溫-20的0.01mol/L pH7.4磷酸緩沖液；0.05mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6)；封閉液：含5g/100mL胎牛血0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中定容；底物顯色液：10mg鄰苯二銨溶于25mL底物緩沖液中，加入10μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)30% H2O2混勻；終止液：2mol/L H2SO4溶液。

Model 680酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司；N-1000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 日本Eyela公司。

1.2 方法

1.2.1 抗原、抗體最佳工作濃度的確定

用方陣試驗法對間接競爭法ELISA試劑盒中抗原抗體最適工作質(zhì)量濃度進(jìn)行選擇。0.05mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液將包被抗原稀釋成不同質(zhì)量濃度后，包被酶標(biāo)板，每一種包被濃度設(shè)置不同的抗體質(zhì)量濃度。OD490nm為1.0左右，抗體抗原用量較少，即為抗體抗原工作質(zhì)量濃度[8]。

1.2.2 丙酮溶劑對抗原、抗體結(jié)合反應(yīng)的影響

間接競爭ELISA法檢測過程中，加入甲拌磷多克隆抗體之前分別添加體積分?jǐn)?shù)為5%、10%、20%和30%丙酮的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，以不加丙酮為對照，每個處理3次重復(fù)，計算抑制率，判斷丙酮含量對抗原、抗體結(jié)合反應(yīng)的影響程度，確定丙酮含量。

1.2.3 抗體的特異性檢測

交叉反應(yīng)率是指抗體與結(jié)構(gòu)不同的抗原決定簇發(fā)生結(jié)合的能力，反映了抗體的特異性。利用競爭性抑制試驗方法，分別測定抗體與甲拌磷及結(jié)構(gòu)類似物抑制率，以交叉反應(yīng)率高低比較抗體的特異性[9]。

1.2.4 試劑盒內(nèi)容及操作方法

試劑盒內(nèi)容：96孔酶標(biāo)板(甲拌磷包被抗原包被，2.5%胎牛血清封閉)；甲拌磷多克隆抗體1瓶，1mL；酶標(biāo)二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG)1瓶，200μL；底物鄰苯二胺(OPD)1支，50mg；30%過氧化氫1瓶，每瓶2mL；反應(yīng)終止液1瓶，10mL；底物緩沖液1瓶，每瓶10mL；0.01mol/L pH7.4磷酸緩沖液1瓶，每瓶30mL；洗滌液1瓶，每瓶30mL，于-20℃下保存待用。

操作方法：取出一塊包被有甲拌磷包被抗原且封閉好的酶標(biāo)板，恢復(fù)室溫后備用；加入50μL標(biāo)樣或處理好的樣品到各孔中；加入甲拌磷多克隆抗體，每孔50μL，37℃孵育1h；倒出孔中的液體，用100μL稀釋好的洗滌液洗3次；加入50μL稀釋的酶標(biāo)二抗，37℃孵育1h；倒出孔中的液體，用100μL洗滌液洗3次；加入底物顯色液100μL，并在37℃避光顯色30min；加入50μL反應(yīng)終止液，混合好后在490nm波長處測定OD值。

1.2.5 試劑盒的結(jié)果判定

配制1、10、50、100、200、500、1000、2000、5000μg/L的甲拌磷溶液，在加入甲拌磷多克隆抗體前分別添加到酶標(biāo)板中，每個質(zhì)量濃度重復(fù)3次，分別以空白和不加甲拌磷溶液為對照，采用間接競爭ELISA法進(jìn)行檢測。以甲拌磷溶液質(zhì)量濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，即得其標(biāo)準(zhǔn)曲線，由圖即可得其靈敏度。抑制率計算公式為：

式中：ODmax為不加農(nóng)藥時的光密度；ODx為加農(nóng)藥時的光密度；ODmin為空白對照的光密度。

1.2.6 試劑盒的回收率、精密度和有效期測定

1.2.6.1 樣品的前處理

將水稻植株、小麥植株樣品切碎，水稻種子、小麥種子、土壤樣品直接稱量，每份20g分別裝入三角瓶中。添加甲拌磷到樣品中，每個質(zhì)量濃度重復(fù)3次。在樣品中加入90mL丙酮提取5min。提取液用布氏漏斗抽濾，用10mL丙酮沖洗濾渣，用二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉進(jìn)行干燥后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮近干，丙酮定容至1mL，進(jìn)行ELISA分析[9]。

1.2.6.2 加標(biāo)回收實驗

分別取10、100、1000μg/kg的甲拌磷標(biāo)樣添加到樣品中，用間接競爭ELISA法測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出檢測的甲拌磷質(zhì)量濃度，計算添加回收率與變異系數(shù)。

1.2.6.3 精密度實驗

分別取10、100、1000μg/kg甲拌磷添加到樣品中，用間接競爭ELISA法測定其批內(nèi)和批間變異系數(shù)。

1.2.6.4 試劑盒有效期

取同一批次試劑盒分別保存于4℃和-20℃，0、30、60、90、120、150、180、210、240、270d時，使用試劑盒測定添加到土壤中的甲拌磷，通過結(jié)果判斷試劑盒的有效性。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原抗體的最佳工作質(zhì)量濃度

表1 間接ELISA法中抗原、抗體最適工作質(zhì)量濃度方陣試驗結(jié)果Table 1 Optimal concentrations of antigen and antibody during indirect ELISA assay

經(jīng)方陣實驗結(jié)果(表1)，OD490nm為1.026時對應(yīng)的包被抗原和抗體的質(zhì)量濃度為最適工作質(zhì)量濃度，即甲拌磷包被抗原的最佳工作質(zhì)量濃度為4mg/L，抗體的最佳稀釋倍數(shù)為8000倍。

2.2 丙酮體積分?jǐn)?shù)對抗原、抗體結(jié)合反應(yīng)的影響

由表2可以看出，隨著丙酮比例加大，對顯色反應(yīng)的抑制逐漸增大，丙酮體積分?jǐn)?shù)5%時對抗原抗體結(jié)合能力影響最小，選定丙酮體積分?jǐn)?shù)為5%。

表2 丙酮含量對抗原、抗體結(jié)合反應(yīng)的影響Table 2 Effect of acetone concentration on conjugation between antigen and antibody

2.3 抗體特異性檢測結(jié)果

甲拌磷多克隆抗體對結(jié)構(gòu)類似的相關(guān)化合物進(jìn)行交叉反應(yīng)實驗，結(jié)果表明該試劑盒與絕大多數(shù)有機(jī)磷農(nóng)藥沒有強(qiáng)烈的交叉反應(yīng)，與所測有機(jī)磷農(nóng)藥的交叉反應(yīng)率均小于20%(表3)。

表3 抗甲拌磷抗體的特異性實驗Table 3 Specificity experiments of anti-phorate antibody

2.4 試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線及靈敏度

采用間接競爭ELISA法，以標(biāo)準(zhǔn)甲拌磷溶液質(zhì)量濃度對數(shù)(lgC)為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，即得其標(biāo)準(zhǔn)曲線：y =18.846x＋6.9949，甲拌磷質(zhì)量濃度在1～5000 μg/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.9401，最低檢測限為4.90μg/L，IC50為191.37μg/L。

2.5 加標(biāo)回收實驗結(jié)果

用甲拌磷間接競爭ELISA試劑盒測定5種不同的樣品的添加回收率(表4)，結(jié)果表明添加回收率均高于75%，變異系數(shù)小于10%，說明本方法準(zhǔn)確可靠。

表4 ELISA試劑盒測定樣品中甲拌磷添加回收率實驗結(jié)果Table 4 Recovery rate experimental results of samples spiked with phorate determined by ELISA kit

2.6 精密度實驗結(jié)果

用甲拌磷間接競爭ELISA試劑盒測定5種不同樣品的添加量來衡量其精密度(表5)，結(jié)果表明試劑盒的批內(nèi)變異系數(shù)在4.18%～7.81%之間，小于8%，批間變異系數(shù)在6.17%～8.39%之間，小于9%，說明該試劑盒精密度很好。

表5 ELISA試劑盒測定樣品中甲拌磷的精密度實驗結(jié)果Table 5 Precision experimental results of phorate determination in samples by ELISA kit

2.7 試劑盒有效期實驗結(jié)果

表6 抗體有效期實驗結(jié)果Table 6 Experimental results of valid period of ELISA kit

經(jīng)甲拌磷間接競爭ELISA試劑盒測定土壤中添加樣品含量，結(jié)果表明試劑盒在4℃和-20℃條件下保存至270d有效(表6)。

3 結(jié) 論

本研究在自主合成甲拌磷半抗原，并免疫制得甲拌磷多克隆抗體的基礎(chǔ)上[7]，研制了一種適用于檢測樣品中甲拌磷殘留的間接競爭ELISA試劑盒，并對試劑盒的靈敏度、特異性、精密度、準(zhǔn)確度和有效期進(jìn)行測定。研制的試劑盒檢測限為4.90μg/L，IC50為191.37μg/L，線性檢測范圍1～5000μg/L，交叉反應(yīng)率小于20%，供試樣品檢測結(jié)果的批內(nèi)、批間變異系數(shù)均低于10%，回收率均高于75%，試劑盒在4℃或-20℃下至少可保存270d，試劑盒穩(wěn)定性較好。目前，甲拌磷在糧食作物上不允許殘留，本研究研制的試劑盒可通過加強(qiáng)免疫，提高抗血清的效價，進(jìn)一步提高靈敏度，使其更好地應(yīng)用到環(huán)境及食品中的甲拌磷殘留檢測。

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Development of Indirect ELISA Kit for Detecting Phorate Residue

WEI Song-hong，PANG Ruo-lin，WANG Chong，JI Ming-shan，GU Zu-min， QI Zhi-qiu，WANG Ying-zi
(College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

An indirect enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)kit was developed to monitor phorate residue. The optimal concentration of coating antigen was 4 mg/L and the optimal dilution ratio of antibody was 8000. The cross-reaction ratio was less than 20%. The regression equation of inhibition rate for phorate was y = 18.846x＋6.9949 with a linear detection range of 1-5000μg/L. Results indicated that the detection limit was 4.90μg/L and IC50was 191.37μg/L. The recovery rates were higher than 75%. The intra-assay and inter-assay coefficients were less than 10%. The developed kit can be stored at 4℃ or -20 ℃ for 270 days.

phorate；residue；enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)；kit

S482.4

B

1002-6630(2011)04-0284-04

2010-04-14

沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)中、青年碩士生導(dǎo)師資助項目

魏松紅(1974—)，女，副教授，博士，研究方向為農(nóng)藥學(xué)。E-mail：songhongw125@163.com