保肝消脂顆粒對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠抵抗素、細(xì)胞色素P450影響的研究

謝晶日，梁國英，李明

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

近年來，脂肪肝發(fā)病率逐年增高，較5年前增加了50倍，且漸趨低齡化。北京、上海等地健康人群普查發(fā)現(xiàn)，脂肪肝患病率達(dá)10% ～15%。有資料報(bào)道，60%～90%的肥胖患者有肝細(xì)胞脂肪變性。脂肪肝的防治應(yīng)該引起我們足夠的重視。經(jīng)過20余年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)及實(shí)驗(yàn)研究，謝晶日教授經(jīng)驗(yàn)方－保肝消脂顆粒是治療非酒精性脂肪肝的有效藥物，在改善臨床癥狀、降脂、保肝方面療效確切［1］，但其具體降脂保肝的作用機(jī)理尚不十分明確。該研究旨在通過觀察保肝消脂顆粒對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝組織抵抗素、細(xì)胞色素P450表達(dá)的治療作用，探討保肝消脂顆粒治療脂肪肝的機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠共60只，體質(zhì)量(190±10)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 保肝消脂顆粒(柴胡、黃芪、決明子、龍膽草、何首烏、姜黃、豬苓等組成)由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室提供。并制成含生藥0.212g/ml溶液;辛伐他汀(宜昌長(zhǎng)江藥業(yè)有限公司，批號(hào)H20056876)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 電子稱、移液器、勻漿機(jī)、酶標(biāo)儀、抵抗素、細(xì)胞色素P450ELISA試劑盒。

1.4 建立動(dòng)物模型［2］參照陸元善等人的造模方法，采用高脂飼料喂養(yǎng)，建立非酒精性脂肪肝大鼠模型，共喂養(yǎng)8周。

1.5 動(dòng)物分組及處理方法 將60只Wistar大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1周，采用隨機(jī)方法分組:根據(jù)體重將大鼠標(biāo)號(hào)(1～60號(hào))，按照隨機(jī)排列表，將動(dòng)物編號(hào)與表中的隨機(jī)數(shù)字對(duì)應(yīng)，將60只大鼠分為6組，每組10只，即空白組、模型組、保肝消脂顆粒低劑量組、保肝消脂顆粒中劑量組、保肝消脂顆粒高劑量組、辛伐他汀組。空白組:采用普通飼料飼養(yǎng)，正常飲水，16周后處死;模型組:前8周高脂飲食造模，后8周普通飼料飼養(yǎng)，正常飲水;保肝消脂顆粒低劑量組:前8周高脂飲食造模、后8周正常飼養(yǎng)的同時(shí)給予0.212g/kg藥物灌胃，每日1次;保肝消脂顆粒中劑量組:前8周高脂飲食造模、后8周正常飼養(yǎng)的同時(shí)給予0.424g/kg藥物灌胃，每日1次;保肝消脂顆粒高劑量組:前8周高脂飲食造模、后8周在正常飼養(yǎng)的同時(shí)給予0.848g/kg藥物灌胃，每日1次;辛伐他汀組:前8周高脂飲食造模，后8周在正常飼養(yǎng)的同時(shí)給予4mg/kg的藥物灌胃(將辛伐他汀分散片溶入蒸餾水中，配成濃度為2mg/ml的溶液)，每日1次。

1.6 標(biāo)本采集與處理 造模、治療結(jié)束后，觀察大鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、皮毛光澤度，稱體重，脫頸椎法處死大鼠，迅速剖腹，觀察肝臟外型、色澤、質(zhì)地，稱取全肝濕重并記錄，取相同部位肝組織，用勻漿器勻漿，按照試劑盒要求采用ELISA法測(cè)定肝組織勻漿抵抗素、細(xì)胞色素P450的含量。

1.7 病理學(xué)檢測(cè) 取肝右葉部位相同大小相等兩塊肝組織放入4%甲醛中固定，石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察各大鼠肝臟脂肪病變及炎癥表現(xiàn)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(±s)表示，計(jì)量資料采取方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝組織勻漿抵抗素水平變化比較 結(jié)果見表1。

表1 各組對(duì)肝勻漿組織抵抗素水平的影響(±s)

表1 各組對(duì)肝勻漿組織抵抗素水平的影響(±s)

注:與模型組比較，*P＜0.05，與辛伐他汀組比較，△P＜0.05。

空白組 10 245.36 ±26.27*模型組 10 1020.87 ±23.21保肝消脂低劑量組 10 832.21 ±22.70＊△保肝消脂中劑量組 10 680.04 ±39.47＊△保肝消脂高劑量組 9 333.35 ±18.19＊△辛伐他汀組 10 391.30 ±60.50*

從表1可以看出，模型組大鼠肝勻漿抵抗素水平顯著上升，與空白組、中藥組、西藥組之間差異明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。保肝消脂低、中、高劑量組與辛伐他汀組之間差異明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。保肝消脂低、中、高劑量組之間差異顯著，也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 各組肝組織勻漿細(xì)胞色素P450水平變化 結(jié)果見表2。

表2 各組對(duì)肝組織勻漿細(xì)胞色素P450水平的影響(±s)

表2 各組對(duì)肝組織勻漿細(xì)胞色素P450水平的影響(±s)

注:與模型組比較，*P ＜0.05，與辛伐他汀組比較，△P ＜0.05。

空白組 10 388.39 ±28.90*模型組 10 965.63 ±27.54保肝消脂低劑量組 10 775.51 ±156.82＊△保肝消脂中劑量組 10 691.00 ±26.03＊△保肝消脂高劑量組 9 473.79 ±20.28*辛伐他汀組 10 516.04 ±17.42*

從表2可以看出，模型組大鼠肝勻漿細(xì)胞色素P450水平顯著上升，與空白組、中藥組、西藥組之間差異明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。中藥低、中劑量組與辛伐他汀組之間差異明顯有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。保肝消脂高劑量組與辛伐他汀組之間有差異，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

非酒精性脂肪肝(non－alcoholic fatty liver，NAFL)是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征。其發(fā)病率在一般人群中為20%，現(xiàn)已成為我國常見的慢性肝病之一。根據(jù)其病理改變可分為單純性脂肪肝、脂肪性肝炎和脂肪性肝硬化［3］。隨著現(xiàn)代社會(huì)飲食結(jié)構(gòu)的變化，非酒精性脂肪肝的發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)，已經(jīng)成為臨床常見肝病。因此如何有效防治NAFLD可阻止慢性肝病進(jìn)展并改善患者預(yù)后，提高患者的生活質(zhì)量。至今，NAFLD發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚。近年來大量研究證明，胰島素抵抗(IR)和線粒體功能紊亂與NAFLD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，IR是NAFLD發(fā)病的始動(dòng)及中心環(huán)節(jié)，可能貫穿于NAFLD發(fā)病全過程［4－5］。然而胰島素抵抗的分子病理學(xué)機(jī)制是多因素的，抵抗素是其中分子之一，是一種約1215u的多肽，屬于C末端富含半胱氨酸的抵抗素樣分子家族(RELMs)，因其可誘導(dǎo)小鼠胰島素抵抗而被命名。最近研究發(fā)現(xiàn)，無論大鼠或人類在發(fā)生慢性肝損害時(shí)均可導(dǎo)致抵抗素在肝臟顯著表達(dá)［6］。Bertolani［7］報(bào)道在人類正常對(duì)照組可見抵抗素在肝臟的表達(dá)，NASH組表達(dá)增強(qiáng)，且表達(dá)量與NASH炎癥活動(dòng)度計(jì)分正相關(guān)。細(xì)胞色素P450(CYP)主要有CYPlA、2E和3A，是由CYP基因超家族編碼形成的一族相對(duì)非特異性酶，它是藥物代謝與失活作用以及身體其他外來物質(zhì)代謝的重要的酶。史洪濤等［8］利用免疫組織化學(xué)、Western blot方法、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定測(cè)定肝細(xì)胞色素P4501A1表達(dá)變化，結(jié)果顯示肝細(xì)胞色素P4501A1基因及蛋白表達(dá)隨著脂肪肝程度的加重明顯增強(qiáng)，表明了NAFLD大鼠肝細(xì)胞色素P4501A1基因的表達(dá)變化與脂肪肝引起的肝臟損害程度密切相關(guān)，肝細(xì)胞色素P4501A1參與了NAFLD的發(fā)生。研究顯示，細(xì)胞色素P450ⅡE1(CYPⅡE1)是二甲基亞硝胺D－脫甲基酶，主要在肝臟表達(dá)，參與許多內(nèi)源性及外源性化合物的代謝，CYP2E1的水平與脂肪變的程度相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠的抵抗素、細(xì)胞色素P450水平明顯增高，通過保肝消脂顆粒干預(yù)后，大鼠肝指數(shù)降低的同時(shí)，抵抗素、細(xì)胞色素P450水平下降，表明肝臟抵抗素、細(xì)胞色素P450參與了脂肪肝的形成，而藥物尤其是中藥保肝消脂顆粒可以明顯下調(diào)抵抗素、細(xì)胞色素P450的表達(dá)。據(jù)此可以推斷，保肝消脂顆粒調(diào)節(jié)脂肪代謝機(jī)制可能是通過影響抵抗素、細(xì)胞色素P450的表達(dá)及敏感性來調(diào)節(jié)人體內(nèi)脂肪的代謝過程，從而治療非酒精性脂肪肝性肝病，達(dá)到既保肝又能降低血脂的作用，這亦可能是該藥物作用的靶點(diǎn)之一。

［1］謝晶日，張?zhí)K，王海強(qiáng)，等.保肝消脂沖劑治療脂肪肝的臨床觀察［J］.中國中醫(yī)藥科技，2008，15(2):140.

［2］謝晶日，楊芳，陳飛，等.保肝消脂顆粒對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝組織瘦素的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2010，38(4):31－33.

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