紫蘇乙醇提取物抑菌活性研究

程道梅，王中鳳，曾凡坤，余小平

（1.成都醫(yī)學院公共衛(wèi)生系，四川 成都 610083；2.西南大學食品科學學院，重慶 400716）

高效、安全或具有一定的營養(yǎng)保健功能的天然食品防腐劑的研發(fā)已成為營養(yǎng)與食品衛(wèi)生領域研究的熱點之一［1，2］。紫蘇（Perilla frutescens（L.）Britt）是我國衛(wèi)生部公布的藥食兩用植物之一，在醫(yī)藥、食品等領域具有重要開發(fā)價值，但關于其抗菌活性，國內(nèi)外的研究大多局限于紫蘇精油［3，4］。本研究以紫蘇莖葉為原料，對其乙醇提取物的抗菌性能及相關影響因素進行了比較系統(tǒng)的分析，以期為紫蘇抗菌資源的合理開發(fā)利用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

紫蘇莖葉購自重慶市中藥研究所標本園。大腸桿菌Escherichia coli；枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis；金黃色葡萄球菌Staphylococcus arueus；總狀毛霉Mucor racemosus；米根霉Rhizopus oryzae；青霉Penicillium sp；黑曲霉Aspergillus niger723；熱帶 假 絲 酵 母 Candia tropicalis（Castellani）Berkhout；啤酒酵母Sacharomyces cerevisiae JW－23。分別由西南農(nóng)業(yè)大學食品學院、資源環(huán)境學院和動物養(yǎng)殖學院微生物教研室提供。霉菌用培養(yǎng)基：高鹽察氏培養(yǎng)基［5］。細菌用培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基［6］。酵母菌用培養(yǎng)基：麥氏瓊脂［5］。結晶紫染色液、沙黃復染液、革蘭氏碘液［6］。伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基：上海市醫(yī)學化驗所試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 抗菌成分提取工藝流程 紫蘇莖葉→干燥→粉碎→浸提→過濾→濃縮→過濾除菌→提取液原液（1g／ml，即1ml提取液相當于1g紫蘇干物質(zhì)［7］）。

1.2.2 抗菌性試驗方法－濾紙片法［8］菌懸液的制備：梯度稀釋法。恒溫培養(yǎng)后，以菌能長滿整個培養(yǎng)皿且分布均勻為適宜的菌液濃度。濾紙片的制備：將濾紙制成直徑為8mm的圓片，160℃干熱滅菌2h，浸入各提取液及乙醇中，4h后取出，無菌條件下晾干備用。抑菌效力的測定：將濾紙片放到涂布了菌懸液的平板培養(yǎng)基表面，恒溫培養(yǎng)后，量取抑菌圈直徑，直徑越大抗菌活性越強。

1.2.3 最低抑菌濃度（MIC）的測定－平板稀釋法［5，6］取適量提取液原液加入到無菌培養(yǎng)皿中與培養(yǎng)基混合均勻，使提取液的濃度分別為10%、5%、2.5%、1.25%、0.625%、0.313%。吸取適宜濃度的菌懸液，恒溫培養(yǎng)。以完全無菌生長的最低濃度作為紫蘇提取液的最低抑菌濃度（MIC）。以乙醇作對照。

1.2.4 抗菌活性pH值范圍的測定 用0.1mol／L檸檬酸溶液和2%NaOH溶液分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH 值為3、4、5、6、7、8。然后用各菌的 MIC濃度的提取液進行抗菌性試驗，以乙醇作對照，確定其pH活性范圍（方法同MIC）。

1.2.5 抗菌活性成分的熱穩(wěn)定性試驗 將提取液原液分別置于80、100、121℃的濕熱條件下處理15min后，以對各菌的MIC濃度的提取液進行抗菌試驗，考察抗菌活性成分的熱穩(wěn)定性。

1.2.6 食鹽、蔗糖對紫蘇提取液抗菌活性的影響試驗 在基礎培養(yǎng)基中分別加入氯化鈉和蔗糖，使氯化鈉含量分別達到3%、5%、7%、9%，蔗糖含量分別為30%、40%、50%，以比各菌的 MIC低一個濃度梯度的提取液原液進行抗菌試驗，以乙醇為對照（方法同MIC測定）。

2 結果

2.1 紫蘇乙醇提取液抗菌譜

紫蘇莖葉的95%乙醇提取液抗菌譜較廣，對所試細菌、酵母和霉菌均有明顯的抑制效果，抑制強度依次為細菌、酵母、霉菌（表1）。

表1 乙醇提取液的抗菌活性Tab.1 Antimicrobial activity of Perilla frutescens alcohol extracts

2.2 紫蘇乙醇提取液對各菌的最低抑菌濃度（MIC）

提取液濃度為0.625%時，3種細菌的生長即完全受到抑制；提取液濃度為1.25%時，酵母菌和霉菌的生長被完全抑制。而對照培養(yǎng)皿中各菌均表現(xiàn)出強的生長勢。因此，紫蘇提取液對所試細菌的MIC為0.625%，對所試酵母菌和霉菌的 MIC為1.25%。（表2）

2.3 pH對紫蘇乙醇提取液抗菌活性的影響

在pH3～7范圍內(nèi)，當提取液的濃度分別為0.625%（對細菌）和1.25%（對酵母菌和霉菌）時，均能完全抑制所試微生物的生長，隨著pH進一步升高，達到8時，抑制活性有所減弱，微生物有所生長，但其生長勢比對照弱。未添加紫蘇提取液的基質(zhì)，在pH＜5時，各菌的生長受到較大程度抑制，但當pH為6以上時，對各菌的生長抑制減弱（表3）。

表2 乙醇提取液濃度對其抑菌效力的影響Tab.2 Antimicrobial potency of different Perilla frutescens extract concentration

2.4 紫蘇提取液抗菌活性的熱穩(wěn)定性試驗

100℃，加熱15min，紫蘇提取液的抗菌活性不受影響，121℃，15min的高溫處理會使其抗菌活性減弱（表4）。

2.5 食鹽、蔗糖對紫蘇提取液抗菌活性的影響

與對照相比，以0.313%紫蘇提取液＋3%食鹽培養(yǎng)的細菌生長勢明顯減弱。當食鹽濃度為5%時，細菌的生長完全受到抑制。以0.625%紫蘇提取液＋3%～5%食鹽培養(yǎng)的酵母菌和霉菌的生長勢較對照減弱，食鹽濃度為7%以上時，其生長完全被抑制，而對照皿中，當食鹽濃度為7%以上時，所試各菌仍能生長（表5）。

表3 基質(zhì)pH對紫蘇抗菌活性的影響Tab.3 Effect of base pH on antimicrobial activity of Perilla frutescens

表4 熱處理對提取液抗菌活性的影響Tab.4 Effect of heat－treatments on antimicrobial activity of perilla frutescens extract

紫蘇提取液濃度為0.313%，蔗糖濃度為40%時，細菌的生長即完全受到抑制。當其濃度為0.625%，蔗糖濃度為30%～40%時，酵母菌和霉菌的生長勢較對照減弱，而對照皿中，當蔗糖濃度為50%時，各菌仍能生長（表6）。

3 討論

性能良好的食品防腐劑應具有廣譜、高效、安全、熱穩(wěn)定性好等特性［9］。紫蘇為“藥食兩用”植物資源，具有抗氧化、抑酶、抑菌等特性［10］，在食品、藥品領域均有悠久的應用歷史。紫蘇中含有紫蘇醛、丁香酚、蘇烯酮、紫蘇醇、檸檬烯、檸檬醛、多酚類等多種生物活性物質(zhì)［11，12］，尤其是多酚類和黃酮類，可通過作用于微生物的細胞亞結構而具有廣譜的抑菌作用［13］。有學者通過對紫蘇抗菌作用的研究發(fā)現(xiàn)，紫蘇油中的揮發(fā)性成分紫蘇醛和檸檬醛具有一定的協(xié)同抗真菌能力。還有研究表明，紫蘇油和桂皮油對蜂蜜的保藏存儲中自然污染的霉菌和酵母菌的抑制能力明顯高于尼泊金乙酯和苯甲酸。本研究的結果也顯示紫蘇提取液抑菌譜較廣，對細菌、霉菌和部分酵母菌抑制作用較強，最低抑菌濃度MIC較低（細菌0.625%；霉菌、酵母菌：1.25%），與黃丹和劉達玉［14］的研究結果一致。

表5 紫蘇提取液與食鹽的協(xié)同抑菌作用Tab.5 Synergic antimicrobial effect between Perilla frutescens extract and salt

表6 蔗糖對紫蘇提取液抗菌活性的影響Tab.6 Effect of sucrose on antimicrobial activity of Perilla frutescens extract

常用的苯甲酸、山梨酸及其鹽類為酸性防腐劑，在酸性條件下才能發(fā)揮較好的防腐效果［15］。本研究結果顯示在pH3～8范圍內(nèi)，紫蘇提取液能較好抑制所試微生物的生長，可見其具有較寬的pH值范圍，不僅可用于酸性食品，還可用于弱堿性食品的保藏。

加熱是食品加工與保藏中最重要的處理方法之一，防腐劑要發(fā)揮其抑菌作用必須具有一定的耐熱性。本研究結果顯示，紫蘇提取液熱穩(wěn)定性較好，100℃加熱15min抗菌活性不受影響。

此外，食鹽和蔗糖為食品中的常見成分，均會對防腐劑的功能發(fā)揮產(chǎn)生一定影響［15，16］。而本研究結果顯示紫蘇提取液與5%以上食鹽及40%以上濃度的蔗糖存在明顯協(xié)同抑菌作用。提示可將其應用于腌漬等食品中。我國民間早有將紫蘇葉放入泡菜壇中抑制白膜生長的實踐，效果良好。高建華和秦燕［17］將紫蘇醛應用在肉制品防腐試驗中，發(fā)現(xiàn)可有效降低微生物的生長能力，減少其生長量。綜上所述，紫蘇可作為一種優(yōu)質(zhì)的天然抗菌植物資源加以開發(fā)利用。本課題組的另一篇文章將報道紫蘇莖葉乙醇提取物在鹵肉等食品中的防腐效果及其抑菌活性成分的分離方法，為進一步研究其抑菌機理提供線索。

［1］肖素榮，李京東.天然食品防腐劑及其發(fā)展前景［J］.中國食物與營養(yǎng)，2007，10（6）：130－133.

［2］李娟萍，呂嘉櫪.生物防腐劑在乳制品中的應用［J］.食品研究與開發(fā)，2007，28（1）：162－165.

［3］郭群群，杜桂彩，李榮貴.紫蘇葉揮發(fā)油抗菌活性研究［J］.食品工業(yè)科技，2003，24（9）：25.

［4］Chen JH，Xia ZH，Tan RX.High－performance liquid chromatographic analysis of bioactive triterpenes in Perilla frutescens［J］.J Pharma Bio Anal，2003，32（1）：1175－1179.

［5］沈萍，范秀容，李廣武.微生物學實驗［M］.北京：高等教育出版社，1999：157.

［6］孟昭赫.食品衛(wèi)生檢驗方法注解－微生物學部分［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1990：50.

［7］周邦靖.常用中藥的抗菌作用及其測定方法［M］.重慶：科學技術出版社重慶分社，1987：289.

［8］鄭鈞鏞，王光寶.藥品微生物學及檢驗技術［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1989：351－352.

［9］高彥祥.食品添加劑［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，2011：15.

［10］黃丹，嚴芳，劉達玉，等.紫蘇提取物的特性及應用［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38（10）：5094－5096.

［11］于長青，趙煜，朱剛，等.紫蘇葉的藥用研究［J］.中國食物與營養(yǎng)，2008，11（1）：52－53.

［12］蒲海燕，李影球，李梅.紫蘇功能性成分及其產(chǎn)品開發(fā)［J］.中國食品添加劑，2009，30（2）：133－137.

［13］郭群群，杜桂彩，李榮貴，等.紫蘇抗菌活性成分的研究［J］.高等學?；瘜W學報，2006，27（7）：1292－1294.

［14］黃丹，劉達玉.紫蘇提取物抑菌特性研究［J］.食品工業(yè)，2007，28（3）：11－13.

［15］劉鐘棟.食品添加劑原理及應用技術［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，2000：4－7.

［16］萬素英，李琳，王慧君.食品防腐與防腐劑［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，1998：95.

［17］高建華，秦燕.一些天然防腐劑的抗菌效果［J］.廣州食品工業(yè)科技，1997，13（3）：5－7.