顏丕熙，李國新，吳曉剛，閆麗萍，滕巧泱，李澤君

（中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 農業(yè)部動物寄生蟲學重點開放實驗室，上海 200241）

2010年春季以來，上海市、江蘇省、浙江省、安徽省等地相繼爆發(fā)一種導致蛋鴨減產(chǎn)、生長遲緩和死亡的一種新發(fā)病，研究證明引起該病的病原為坦布蘇病毒（Tembusu virus）[1,2]。該病毒可經(jīng)空氣傳播，對蛋鴨及肉鴨均有致病力。病鴨主要表現(xiàn)為高熱、運動障礙、食欲下降甚至廢絕、產(chǎn)蛋下降甚至停止，嚴重可導致死亡，死亡率可達5%～10%。剖檢可見脾臟明顯腫大；肝臟出血嚴重，伴有針尖狀白色壞死點；卵巢發(fā)生出血、萎縮、破裂，輸卵管有粘液[1,2]。由于該病毒為新發(fā)病原，目前尚無可靠的檢測方法。本研究組曾使用RT-PCR方法對臨床樣品進行檢測，但發(fā)現(xiàn)RT-PCR的敏感性比較差，不能有效的檢測出該病毒。近年來套式RTPCR在疾病的診斷方面顯示出靈敏、特異的優(yōu)點，在登革熱病毒[3]、蜱傳腦炎病毒[4]和西尼羅病毒[5]等黃病毒的檢測中都得到了很好應用。鑒于此，本研究建立了套式RT-PCR方法，該方法能夠快速、敏感、特異地檢測出鴨坦布蘇病毒，為該病快速診斷與流行病學調查奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 鴨坦布蘇病毒的增殖 鴨坦布蘇病毒（FX2010）由本研究室分離鑒定。取保存的病毒液100 μL接種9日齡SPF雞胚，收集24～120 h死亡雞胚胚體，胚體研磨后，7500×g離心30 min，吸取上清，滴定病毒含量后，用于后續(xù)試驗。

1.2 引物設計 根據(jù)坦布蘇病毒（FX2010）E基因序列設計兩對特異性的重疊引物（表1），引物由上海Invitrogen公司合成，用DEPC水稀釋至終濃度為10 μmol/L，分裝后凍存于-20℃。

1.3 病毒RNA的提取 取1.5 mL Eppendorf管，向其內加入500 μL上述病毒液、800 μL Trizol(Invitrogen)，靜置5 min；加入0.2 mL氯仿，振蕩15 s，靜置2～3 min；4℃離心10 min，吸取上清并加入等體積的異丙醇，沉淀10 min；4℃ 10 800×g離心10 min，棄上清，用75%酒精清洗沉淀，混勻后，10 800×g離心10 min；倒掉上清，RNA自然干燥，用20 μL DEPC水溶解RNA。

1.4 反轉錄 將5μL RNA提取液與2 μL Random 9（TaKaRa）混勻，70 ℃保溫10 min，迅速冰浴2 min，然 后 分 別 加 入 4 μL 5×AMV Buffer、1μL RRI、1μL AMV（Takara）、1 μL 10 umol/L dNTP、6 μL DEPC水，共20 μL，混勻后30 ℃保溫10 min，42 ℃1 h，75 ℃ 10 min。

1.5 套式RT-PCR方法的建立 第一輪PCR采用25 μL反應體系：12.5 μL PCR Mix（東盛生物），1 μL P1（10 umol/L），1 μL P2（10 umol/L），1 μL cDNA模板，滅菌ddH2O補加至25 μL。置于PCR儀中，94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，53℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，進行25個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照。第二輪PCR采用25 μL體系：取第一輪PCR反應液1 μL為模板，12.5 μL PCR Mix、1 μL P3（10 umol/L）、1 μL P4（10 umol/L），滅菌ddH2O補加至25 μL，置于PCR儀中。94 ℃預變性 4 min；94℃變形 30 s，53 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，進行25個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。1.0%瓊脂糖電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照。

1.6 套式RT-PCR與普通PCR敏感性比較 取病毒液進行10倍系列稀釋（表2）。每個稀釋度取200 μL按上述方法進行RNA提取及反轉錄，所獲得的cDNA取1 μL作為模板，用引物P1、P2進行第一輪擴增，反應結束后進行電泳檢測。以第一次PCR產(chǎn)物（1μL）為模板，用引物P3、P4進行套式RT-PCR擴增。同時利用1μL cDNA作為模板，用引物P3、P4進行普通PCR擴增。反應結束后進行凝膠電泳檢測。

1.7 特異性實驗 以禽流感病毒、新城疫病毒、網(wǎng)狀內皮增生病病毒、鴨肝炎病毒等病毒的核酸反轉錄產(chǎn)物為模板，按上述方法對其進行PCR擴增，每次擴增設雙蒸水作陰性對照，鴨坦布蘇病毒反轉錄cDNA為模板作為陽性對照，擴增反應結束后用凝膠電泳檢測。

1.8 臨床應用 從安徽省、河北省、山東省、 浙江省、上海市等地發(fā)病鴨場采取病鴨脾臟組織，按1g/mL PBS加入PBS進行研磨，4℃ 10 800×g離心10 min。取200 μL上清按上述方法提取病毒RNA及反轉錄，隨后進行套式RT-PCR檢測，擴增反應結束后進行凝膠電泳檢測。將陽性病料接種8日齡SPF鴨胚后分離該病毒，并應用該套式RT-PCR方法對分離病毒的鴨胚尿囊液進行檢測，以確定病毒分離結果。

表1 PCR擴增所需特異性引物Table1 The specific primers for PCR amplication

2 結果

2.1 套式RT-PCR與普通PCR敏感性的比較 將毒價為105.25ELD50/100 μL的病毒液做10倍系列稀釋，每個稀釋度取200 μL提取RNA，反轉錄后取1 μL（見表2）為模板，進行第一輪擴增。凝膠電泳結果顯示，只有毒價為2×105.25/100μL的病毒可以獲得962 bp的目的條帶（圖1A）。用引物P3和P4進行第二輪擴增，結果顯示，毒價為2×103.25/100 μL的病毒可以獲得300 bp的目的條帶（圖1A）。而直接用引物P3和P4進行普通PCR擴增，病毒滴度達到2×104.25/100 μL時才可獲得特異條帶（圖2）。結果表明套式RT-PCR擴增的敏感性較常規(guī)的PCR方法高10倍 （表2）。

表2 套式RT-PCR的敏感性Table 2 Sensitivity comparison between nested RT-PCR assay and RT-PCR

2.2 套式RT-PCR的特異性 以禽流感病毒、新城疫病毒、網(wǎng)狀內皮增生病病毒、鴨肝炎病毒等病毒的核酸反轉錄產(chǎn)物為模板，同時以雙蒸水作陰性對照，以鴨坦布蘇病毒做陽性對照，按上述方法對其進行PCR擴增，結果見圖3。試驗結果顯示此PCR反應對鴨坦布蘇病毒具有特異性。

2.3 臨床樣品檢測 應用該套式RT-PCR方法對浙江省、上海市、山東省、河北省、安徽省等送檢的病料進行PCR擴增，結果陽性病料可獲得了300 bp的目的片段，陽性檢出率為48/63，與病毒分離率為13/63，結果見表3。

表3 臨床樣品檢測Table 3 The detection of clinical samples by nested RT-PCR

3 討論

鴨坦布蘇病毒是2010年新發(fā)現(xiàn)的一種病毒。目前所知，該病毒主要侵害鴨，尤其是蛋鴨，可使蛋鴨采食量下降、生長遲緩、體重下降、產(chǎn)蛋減少甚至停止，并能導致一定的死亡率。剖檢病理特征主要是脾臟腫大、腎臟腫大、嚴重者肝臟后期有針尖狀白色壞死點等。該病毒的致病特點和機理目前尚不十分清楚。目前中國多數(shù)地區(qū)都遭受該病的影響，給蛋鴨養(yǎng)殖業(yè)帶來了極大的損失。

對于該病的診斷，采用傳統(tǒng)的病毒分離方法費時費力，并且敏感性低。本研究建立了RT-PCR方法和套式RT-PCR方法檢測該病毒，并對兩種方法的敏感性作了比較。結果顯示，套式RT-PCR方法比RT-PCR方法1（引物P1、P2）敏感性高100倍，比RT-PCR方法2（引物P3、P4）敏感性高10倍。在特異性試驗中陽性病料可獲得300 bp的目的條帶，而禽流感病毒、新城疫病毒、網(wǎng)狀內皮增生病病毒、鴨肝炎病毒等的擴增結果均為陰性，表明該方法具有良好的特異性。應用該套式RT-PCR對臨床病料進行檢測驗證，結果表明該套式RT-PCR是檢測鴨坦布蘇病毒的有效手段，可用于鴨坦布蘇病毒的臨床診斷和分子流行病學調查。同時，應用該方法可以對病毒分離進行檢測與驗證。綜上所述，本研究所建立的套式RT-PCR能快速、靈敏、特異地檢測出鴨坦布蘇病毒，將為該病的防治與防控發(fā)揮重要作用。

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