唐吉思，吳金花，布日額，張海寶，薛曉陽，劉 洋，張忠祥

（1. 內(nèi)蒙古民族大學動物科技學院，通遼028043；2. 內(nèi)蒙古民族大學生命科學學院，通遼028043；3. 內(nèi)蒙古通遼市家畜繁育指導站，通遼028000）

奶牛乳腺炎（Bovine mastitis）是影響世界奶業(yè)發(fā)展的最主要奶牛疾病之一，它不僅給世界的乳品工業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，而且還危害到公共衛(wèi)生和人類健康[1,2]。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引起奶牛乳腺炎的主要病原菌之一，根據(jù)相關(guān)文獻報道由其引起的奶牛乳房炎占到50%以上[3]。金黃色葡萄球菌可損害乳房上皮細胞和腺泡的功能，使牛奶產(chǎn)量迅速下降，損失量約占總產(chǎn)量的10%～25%[4]。攜帶毒素基因的金黃色葡萄球菌在適當環(huán)境溫度、pH、介質(zhì)下還能產(chǎn)生毒素，影響乳制品的質(zhì)量安全，同時對消費者帶來安全隱患。在引起食品污染和細菌性食物中毒的案例中，金黃色葡萄球菌是僅次于大腸埃希菌的致病菌[5]，約占33%。金黃色葡萄球菌產(chǎn)生多種毒素，主要有腸毒素（staphylococcal enterotoxins，SEs）、剝脫毒素（exfoliative toxins，ETs）和中毒休克毒素（toxic shock syndrome toxin 1，TSST-1）等。其中腸毒素是引起食物中毒的重要因子，它是一類結(jié)構(gòu)相關(guān)、毒力相似、抗原性不同的胞外蛋白質(zhì)[6]，金黃色葡萄球菌腸毒素A（stapylococoal enterotoxin A，SEA）便是其中最重要的腸毒素之一，同時也是經(jīng)常引起暴發(fā)性食物中毒的重要致病因子。在牛乳中若含有足夠量的SEs即可引起食物中毒，患者通常在食入被SEs污染的食物2～6 h后發(fā)病，癥狀為惡心、嘔吐、腹部疼痛和腹瀉[7]。在美國爆發(fā)的食物中毒病例中，SEA所占的比例最大（77.8%），其次為SED（37.5%）和SEB（10.0%）[8]。為了控制金黃色葡萄球菌在食品中的殘留及其造成的危害，對金黃色葡萄球菌腸毒素基因的克隆研究成為生物學界感興趣的研究方向[9,10]。本研究成功克隆了SEA基因片段并進行序列分析，為建立相應的快速檢測牛乳中SEA方法奠定了研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 金黃色葡萄球菌標準菌株（ATCC13565）由東北農(nóng)業(yè)大學乳品中心惠贈；克隆載體pGEM-T easy、DH5α購自廣東東盛生物科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基及抗生素 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、血液瓊脂平板、LB培養(yǎng)基等本實驗室自備；糖發(fā)酵反應管、藥敏紙片（氨芐青霉素、慶大霉素、四環(huán)素、氟哌酸、鏈霉素、環(huán)丙沙星、氯霉素、復方新諾明）購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.3 主要試劑 PCR buffer、dNTP mix、Taq酶等均購自大連寶生物工程有限公司；普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒、蛋白酶K、溶菌酶購自北京索萊寶科技有限公司；質(zhì)粒提取盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；TE （10 mmol /L Tris-HCl，1 mmol /L EDTA，pH 8.0）、10%SDS、飽和酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）、丙酮、無水乙醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細菌的培養(yǎng)、分離及鑒定 將采集的乳樣用接種環(huán)接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h進行增菌。將增菌培養(yǎng)液劃線接種于普通瓊脂平板上，置溫箱37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落形態(tài)。挑取可疑菌落涂片，革蘭氏染色鏡檢，進行純化培養(yǎng)；同時劃線接種鮮血瓊脂平板，置溫箱37℃培養(yǎng)24 h后，觀察培養(yǎng)特性。

1.2.1.1 糖（醇）類發(fā)酵試驗 取18～24 h的菌接種于糖發(fā)酵管中，置37℃培養(yǎng)24～48 h后觀察指示劑顏色以及產(chǎn)氣現(xiàn)象。如果指示劑由紫色變?yōu)辄S色，表明糖類被發(fā)酵而產(chǎn)酸；若指示劑不變色，則表示其對糖類不發(fā)酵；若發(fā)酵管頂部有氣泡出現(xiàn)，則表示產(chǎn)氣。使用甘露醇、果糖、棉子糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖等進行發(fā)酵試驗。

1.2.1.2 血漿凝固酶試驗 將1:4的兔血漿0.5 mL置于潔凈滅菌的小試管中，再加入細菌懸濁液0.5 mL搖勻。另外用標準陽性菌株作為陽性對照，生理鹽水作為陰性對照。

1.2.1.3 接觸酶試驗 用接種環(huán)挑取新鮮的純化菌落置于潔凈載玻片上，滴加1滴3%的過氧化氫溶液，觀察結(jié)果。

1.2.1.4 甲基紅試驗 取少量37℃培養(yǎng)了24～48 h的培養(yǎng)液于另一試管內(nèi)，加幾滴試劑，若培養(yǎng)液呈紅色，則為陽性；如果呈現(xiàn)黃色則為陰性，仍需繼續(xù)培養(yǎng)4～5 d后進行試驗。

1.2.2 PCR擴增SEA 根據(jù)GenBank中公布的Staphylococcus aureus的SEA基因序列，使用Primer 5.0和Oligo 6.0軟件設計引物，該引物擴增片段長度為582 bp（見表1）。模板的制備采用溶菌酶、蛋白酶K消化，氯仿異戊醇抽提的方法[11]。目的基因PCR擴增反應體系如下：10×PCR buffer（Mg+）2.5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）mixture 2 μL、模板 DNA 2 μL、上游引物（20 pmol/μL）1μL、下游引物（20 pmol/μL）1 μL、Taq酶 （5 U/μL）0.5 μL、ddH2O 16 μL，總反應體系 25 μL。PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min，4℃保存。取50 μL的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外透射儀下觀察條帶。

表1 擴增SEA基因片段的引物序列Table 1 Primers used for PCR amplification of SEA gene

1.2.3 PCR產(chǎn)物的克隆和序列測定 按照Solarbio生物公司瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書回收PCR產(chǎn)物，將膠回收產(chǎn)物連接pGEM-T Easy載體，連接體系如下：2×T4連接酶 buffer 5 μL、pGEM-T Easy Vector 1 μL、模板 DNA 1 μL、T4 DNA 連接酶 1 μL、ddH2O 2 μL，總反應體系 10 μL。

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，把轉(zhuǎn)化菌涂布于含有氨芐青霉素的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，并進行藍白斑篩選。挑取白斑于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃震蕩過夜培養(yǎng)，然后按照質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒DNA，陽性克隆質(zhì)粒命名為pGEM-SEA。用PCR方法快速鑒定克隆陽性，反應條件同前。PCR陽性質(zhì)粒再用EcoRⅠ酶來進行酶切鑒定，反應體系如下：重組質(zhì)粒pGEMSEA 5 μL、EcoR Ι 0.5 μL、10× Buffer 2 μL、ddH2O 12.5 μL，總反應體系 20 μL。

陽性質(zhì)粒送上海生工測序，將所獲得序列與GenBank中公布的序列進行比較分析。

2 結(jié)果

2.1 金黃色葡萄球菌的分離、培養(yǎng)及鑒定結(jié)果 分離的細菌在普通瓊脂平板上培養(yǎng)18 h后形成了濕潤、光滑、隆起、邊緣整齊的中等大小的菌落，初期呈灰白色，一段時間后轉(zhuǎn)為金黃色；在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h左右形成的菌落較普通瓊脂平板較大，呈金黃色，圓形隆起、表面光滑、濕潤，邊緣整齊，溶血類型為β型。細菌形態(tài)觀察表明，分離菌株在顯微鏡下呈葡萄狀簇集成堆，少數(shù)成雙或散在，有的以短鏈排列，革蘭氏染色呈陽性。

2.2 生化特性鑒定 分離菌的生化特性鑒定結(jié)果為該菌能發(fā)酵6種糖類，接觸酶試驗、凝固酶試驗及溶血試驗均呈陽性（見表2）。

表2 分離菌生化試驗結(jié)果Table 2 The results of biochemistry identity of Staphylococcus aureus

2.3 目標基因克隆結(jié)果 從臨床采集的金黃色葡萄球菌菌株提取總DNA作為模板，經(jīng)PCR擴增SEA基因后，擴增出大約580 bp的目的條帶，結(jié)果見圖1。

2.4 pGEM-SEA重組質(zhì)粒的篩選及酶切鑒定 SEA的PCR擴增產(chǎn)物克隆入pGEM-T easy載體中，挑取白色菌落擴增培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，PCR篩選陽性質(zhì)粒，用EcoR I進行酶切，消化產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后，得到約580 bp的目的條帶，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，將此質(zhì)粒命名為pGEM-SEA（圖2、3）。

2.5 SEA基因的序列分析 測序結(jié)果表明，克隆的基因序片段列長度為582 bp，與GenBank公布的序列（EF520720.1）比對，核苷酸序列共有5處出現(xiàn)堿基突變，見圖4，相似性達到99.14%。分離株與標準菌株SEA基因序列的相似性達到100%。

3 討論

SEA是其引起食物中毒的主要毒素之一，一旦殘留于原料乳中往往造成食物的安全隱患。但是由于該毒素在100℃下能夠耐受2 h而不被破壞，目前各種乳品生產(chǎn)工藝過程的加熱滅菌過程均不可殺滅它。近年來圍繞其開展研究的基礎報道較多，內(nèi)蒙古自治區(qū)是中國重要的乳品生產(chǎn)與供應基地，開展與乳品安全相關(guān)的基礎研究對于保障廣大乳品消費者安全具有重要意義。

本試驗采集的乳樣來自內(nèi)蒙古通遼市周邊蒙牛乳業(yè)集團所屬奶牛場患有乳腺炎的奶牛，金黃色葡萄球菌總體檢出率在30%左右，經(jīng)過生化試驗及PCR分子鑒定篩選出SEA陽性菌株4個。表明該病原菌在內(nèi)蒙古東部地區(qū)仍屬于主要的病原菌之一，而且產(chǎn)SEA菌株確實存在。

本研究成功地克隆牛源SEA基因片段，長度為582 bp。與GenBank公布的序列（EF520720.1）進行核苷酸序列比對，結(jié)果表明，該片段共有5處堿基突變，相似性達到99.14%?？梢姡瑑?nèi)蒙古地區(qū)牛源SEA具有一定的差異性。

在糖發(fā)酵試驗中，5株金黃色葡萄球菌對甘露醇和蔗糖的發(fā)酵結(jié)果并不完全一致，部分菌株對蔗糖發(fā)酵試驗表現(xiàn)陰性，可能是在傳代培養(yǎng)過程中出現(xiàn)了代謝特征的變異。藥敏試驗表明，所分離的金黃色葡萄球菌對氨芐青霉素表現(xiàn)出明顯的耐藥性，對鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、氯霉素、氟哌酸、復方新諾明也有一定程度的耐藥性，但對四環(huán)素和環(huán)丙沙星敏感性較高，該結(jié)果與王登峰等[12]的報道結(jié)果不一致，可能是因為各地臨床選用抗生素類藥物品種不同，進而造成了耐藥性差異。

臨床上奶牛乳腺炎發(fā)病率很高，特別是隱性乳腺炎造成的危害最為嚴重。為了控制乳腺炎的發(fā)生，業(yè)者通常會給與大劑量的抗生素進行治療與控制，但這樣往往造成大量耐常規(guī)藥物的耐藥菌株產(chǎn)生，并隨著食物直接危害人類。隨著人們對綠色乳品消費的需求，乳品安全問題越來越引起全社會的高度重視，因此加強牛乳品相關(guān)病原菌的基礎研究對控制奶牛乳腺炎的發(fā)生與發(fā)展具有重要意義。

[1]Denis M, Wedlock D N, Lacy-Hulbert S J, et al. Vaccines against bovine mastitis in the New Zealand context: what is the best way forward[J]. N Z Vet J, 2009, 57 (3): 132-140.

[2]Taverna F, Negri A, Piccinini R, et al. Characterization of cell wall associated proteins of a Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis case by a proteomic approach[J]. Vet Microbiol, 2007, 119 (2-4): 240-247.

[3]Talbot B G, Lacasse P. Progress in the development of mastitis vaccines[J]. Livestock Prod Sci, 2005, 98(1-2):101-113.

[4]Kerro-Dego O, Prysliak T, Potter A A. DNA-protein immunization against the GapB and GapC proteins of a mastitis isolate of Staphylococcus aureus [J].Vet Immunol Immunopathol, 2006, 113 (1/ 2): 125-138.

[5]高濤.食品中金黃色葡萄球菌腸毒素及檢測方法的研究進展[J]. 福建分析測試, 2003, 12(2): 1775-1778.

[6]張嚴峻, 張俊彥, 梅玲玲, 等. 金黃色葡萄球菌腸毒素基因的分型和分布[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2005,15(6):682-683.

[7]E. P. Casman and R. W. Bennett. Culture medium for the production of staphylococcal enterotoxin A[J]. Bacteriol,1963, 7(86): 18-23.

[8]Hayes P R. Food Microbiology and Hygiene[M]. London:Elsevier Appied Science, 1985: 38-41.

[9]張紅河, 張衛(wèi)英, 董曉勤, 等. 快速檢測金黃色葡萄球菌腸毒素A基因方法的建立與應用[J]. 中國微生態(tài)學雜志,2006, 18(1): 46-47.

[10]陳悅, 倪培華, 吳潔敏. 金黃色葡萄球菌腸毒素 A基因克隆及表達[ J ]. 檢驗醫(yī)學, 2006, 2l(2): 113-116.

[11]薩姆布魯克J, 拉塞爾D W. 分子克隆實驗指南[M]. 3版.黃培堂, 王嘉璽, 譯. 北京: 科學出版社, 2002, 1256-1259.

[12]王登峰, 李建軍, 段新華, 等. 我國牛源金黃色葡萄球菌耐藥現(xiàn)狀及藥敏試驗方法探討[J]. 中國動物傳染病學報, 2011,19(1): 31-37.