黃 夢，于 海，周艷君，李澤君，馬繼紅，楊馥如，童光志

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

豬流感（swine influenza）是由A型流感病毒引起的，廣泛存在于豬群中的一種嚴重的豬呼吸系統(tǒng)疾病，主要臨床癥狀為突發(fā)、高熱、咳嗽、呼吸困難、衰竭、發(fā)病率高和死亡率低。豬流感病毒（Swine influenza virus，SIV）容易發(fā)生變異，目前已發(fā)現(xiàn)的A型SIV有H1N1、H1N2、H1N7、H2N3、H3N1、H3N2、H3N3、H3N6、H4N6、H5N1和H9N2等11種不同血清亞型，其中在中國廣泛流行的主要是H1N1、H1N2、H3N2三種[1-3]。一直以來，由于豬流感單獨感染不會在豬群中大規(guī)模流行，也不引起豬群的死亡，豬流感在臨床上一直沒有引起廣泛的重視。但是，由于豬流感在公共衛(wèi)生方面的意義，以及近年來豬在流感病毒新亞型產(chǎn)生中具有混合器作用共識的產(chǎn)生，豬流感的研究開始得到重視。2009年爆發(fā)的甲型H1N1流感的病原更是與豬流感病毒有著千絲萬縷的聯(lián)系，研究證實是由一株北美的三元重組毒株H1N1或H1N2與歐亞譜系的H1N1豬源流感病毒重組而來，這一研究結(jié)果甚至導(dǎo)致了“談豬流感色變”的恐慌[4-6]。

反向遺傳學(xué)操作技術(shù)是一種可以從分子水平上探討流感病毒致病性、宿主適應(yīng)性及跨種間傳播的可能性及其機制的熱門技術(shù)。通過對病毒的基因組進行直接的操作和修飾，利用經(jīng)修飾的克隆化的cDNA獲得有感染性的病毒，再對病毒的特性，如生長能力，致病性及宿主適應(yīng)性進行研究，從而對病毒決定其致病力，種間傳播能力的功能位點和基因片段進行定位[7-19]。建立H1N2亞型SIV反向遺傳操作系統(tǒng)，并拯救出能夠在動物傳代細胞中復(fù)制的重組H1N2亞型SIV，能夠為SIV致病機理、傳播機制及病毒基因功能的研究以及新型豬流感疫苗的研制奠定堅實基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 毒株與質(zhì)粒 豬流感毒株A/swine/Shanghai/1/07（H1N2）（簡稱S12）由本實驗室分離保存[20]；八質(zhì)粒流感病毒拯救系統(tǒng)雙向表達載體PBD由李澤君研究員提供。

1.2 菌種和細胞 E.coli JM109感受態(tài)細胞由本實驗室制備；293T細胞由本實驗室保存；SPF雞胚種蛋購自山東昊泰實驗動物繁育有限公司。

1.3 主 要 試 劑 AMV Reverse Transcriptase、LA Taq、dNTP、Klenow大片段均購自TaKaRa大連寶生物工程公司；高保真酶PfuUltra Ⅱ Fusion Hs DNA Polymerase購自Agilent公司；RNA提取試劑盒RNeasy Mini Kit， 質(zhì)粒提取試劑盒QIAGEN Plasmid Purification Kit購自QIAGEN公司；柱式膠回收試劑盒購自上海華舜公司；BspQⅠ、T4 DNA Polymerase、T4 DNA ligase均購自 NEB公司；DMEM培養(yǎng)基、OPTI-MEM培養(yǎng)基、TPCK-trypsion、FCS、Lipofectamine 2000均購自Invitrogen公司。

1.4 主要試劑引物設(shè)計 對GenBank中公布的H1N2亞型流感病毒5'和3'末端保守序列進行比對，并參照文獻[21]，利用Oligo6.0軟件設(shè)計合成擴增流感病毒PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、M和NS基因的引物及流感病毒反轉(zhuǎn)錄通用引物Uni-12，引物由Invitrogen公司合成。

1.5 病毒RNA的提取及RT-PCR擴增 按照RNeasy Mini Kit說明書提取分離保存的雞胚尿囊液中病毒的總RNA，用鼠源反轉(zhuǎn)錄酶AMV Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄獲得病毒cDNA。以此cDNA為模板，用高保真酶PfuUltra Ⅱ Fusion Hs DNA Polymerase擴增病毒的HA、NA、NP、M、NS、PA、PB1、PB2八個基因片段。

1.6 重組質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定及純化 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳后，切下目的條帶，用柱式膠回收試劑盒回收純化。M、NS、HA、NA、NP、PA、PB1和PB2八個基因片段的膠回收產(chǎn)物，在dCTP和dTTP存在的條件下，用T4 DNA Polymerase 12 ℃作用30 min、75 ℃作用20 min。PBD載體經(jīng)BspQⅠ酶切回收后，在dATP和dGTP存在的條件下，用Klenow大片段在25 ℃作用25 min、75 ℃作用20 min，然后分別用膠回收試劑盒回收最終產(chǎn)物，處理好的基因片段與PBD載體，在T4 DNA ligase的作用下16 ℃連接5 h。

連接產(chǎn)物按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞中，取100 μL菌液涂布于含有氨芐青霉素（50 μg/mL）LB平板上，37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取白色孤立菌落，接種于5 mL含有氨芐青霉素（50μg/mL）液體LB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)8 h。菌液PCR鑒定為陽性克隆的，送上海Invitrogen公司進行序列測定。序列正確的質(zhì)粒按照QIAGEN Plasmid Purification Kit的說明書提取質(zhì)粒，并對質(zhì)粒濃度進行精確測定。

1.7 病毒的拯救 按每個質(zhì)粒1 μg的比例，將8個質(zhì)?；旌系酵粋€EP管內(nèi)，加入250 μL無血清的OPTI-MEM培養(yǎng)基。16 μL Lipofectamine 2000與250 μL無血清的OPTI-MEM培養(yǎng)基混合作用5 min。作用好的Lipofectamine 2000加至混合好的質(zhì)粒中，室溫作用20 min。胰酶消化293T細胞接種細胞培養(yǎng)板，過夜培養(yǎng)形成單層。用OPTI-MEM細胞培養(yǎng)液洗單層細胞2次，將上述質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合物加到細胞單層表面。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，棄去上清，添加1.5 mL的含1%犢牛血清的OPTI-MEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。48 h后，用1 mL注射器吸取細胞上清接種于9～11日齡SPF雞胚尿囊腔。置于37 ℃溫箱，24 h后，棄去死亡雞胚，48 h后收集雞胚尿囊液。1.8 獲救病毒的鑒定 收集的雞胚尿囊液，用血凝試驗（HA）檢測，確定其血凝效價，然后將此尿囊液再次接種SPF雞胚，72 h后收集雞胚尿囊液測定其血凝效價。按照RNeasy Mini Kit說明書提取雞胚尿囊液中病毒的總RNA，用鼠源反轉(zhuǎn)錄酶AMV Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄獲得病毒cDNA。以此cDNA為模板，擴增病毒M基因的一段保守區(qū)序列，PCR產(chǎn)物純化克隆后，送上海Invitrogen公司進行序列測定。測序結(jié)果與親本的相應(yīng)序列進行比對，確定拯救的病毒的核苷酸序列與親本的相應(yīng)序列是否相符合。同時，以此cDNA為模板，擴增病毒的HA、NA、NP、M、NS、PA、PB1、PB2八 個 基因片段，并經(jīng)1%諒脂糖凝膠電泳鑒定基因片段大小與預(yù)期是否相符。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR擴增產(chǎn)物的鑒定結(jié)果 從分離保存的雞胚尿囊液中提取病毒的總RNA，分別用8對特征性引物，RT-PCR擴增病毒的8個基因片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，得到的HA、NA、NP、M、NS、PA、PB1、PB2這8個基因片段的大小與預(yù)期相符（圖1）。2.2 重組PBD陽性質(zhì)粒鑒定結(jié)果 8個基因片段連接到PBD載體上后，常規(guī)方法轉(zhuǎn)化到JM109大腸桿菌感受態(tài)細胞中，菌液PCR鑒定為陽性的，送上海Invitrogen公司進行序列測定，測序結(jié)果與實際相符。

2.3 拯救病毒的鑒定結(jié)果 從接種細胞上清的SPF雞胚中收集到的雞胚尿囊液能夠使1%的紅細胞懸液發(fā)生凝集現(xiàn)象。由于S12親本毒株血凝效價很低，僅為1:8，拯救的一代病毒的血凝效價也很低，僅為1:2。將拯救的一代病毒再次接種于SPF雞胚，72 h后收集雞胚尿囊液，再次測得的血凝效價為1:8，與原始毒株完全一致。

提取雞胚尿囊液中病毒的總RNA， 反轉(zhuǎn)錄獲得病毒cDNA。以此cDNA為模板，擴增病毒M基因的一段保守區(qū)序列，PCR產(chǎn)物純化克隆后，經(jīng)序列測定確定拯救病毒的核苷酸序列與親本的相應(yīng)序列相符合。同時，擴增拯救病毒的8個基因片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，基因片段的大小與預(yù)期相符（圖2）。由以，確定重組病毒獲得成功拯救，將此病毒命名為rS12。

3 討論

豬流感是廣泛存在于豬群中一種呼吸系統(tǒng)疾病，單獨感染不引起明顯的癥狀，也不會導(dǎo)致豬群的死亡，但是當(dāng)豬流感病毒與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬支原體等呼吸系統(tǒng)疾病病原混合感染或繼發(fā)時，常常造成嚴重的損失。另外，由于豬流感在公共衛(wèi)生方面的意義，對人類健康存在著潛在的威脅，所以，為了更好防控豬流感，對豬流感病毒的致病機制進行深入研究顯得尤為重要。

反向遺傳操作技術(shù)提供了一個可以從分子水平研究流感病毒致病性、種間傳播能力、病毒變異機制的平臺和基礎(chǔ)。本研究成功構(gòu)建了H1N2亞型豬流感病毒毒株S12的八質(zhì)粒反向遺傳操作系統(tǒng)，從哺乳動物細胞中拯救出有活性的病毒粒子，經(jīng)鑒定各基因片段的序列與原始病毒相應(yīng)序列完全一致。此反向遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建為進一步研究病毒的復(fù)制調(diào)控機制、變異方向、致病性、種間傳播分子機制奠定了基礎(chǔ)，同時也為豬流感新型疫苗的研制開辟了新的途徑。

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