萬均輝 鐘澤艷 田佩玲 韋相才，* 張清健 李銘臻

1.南方醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳教研室(廣州，510080);2.廣東省計劃生育科學(xué)技術(shù)研究所

唐氏綜合征又稱21－三體綜合征或先天愚型，是由于生殖細胞在減數(shù)分裂過程中染色體未分離所致。目前，對于此病尚無有效的治療手段。因此，在孕期及早、準(zhǔn)確地做出診斷，防止患兒出生是降低患病率的重要措施。近年來，建立快速有效、簡便準(zhǔn)確、易于推廣的唐氏綜合征產(chǎn)前診斷方法是研究的熱點之一［1］。傳統(tǒng)細胞遺傳學(xué)方法又稱染色體核型分析是目前公認的診斷染色體異常的金標(biāo)準(zhǔn)，但受細胞培養(yǎng)成功率與核型質(zhì)量不甚穩(wěn)定的影響，該技術(shù)的普及受到一定限制。本研究探討在染色體核型分析基礎(chǔ)上，建立優(yōu)化熒光原位雜交技術(shù)(FISH)，用于產(chǎn)前唐氏綜合征診斷和單細胞植入前遺傳學(xué)診斷(PGD)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

外周抗凝靜脈血采集于廣州智靈學(xué)校;羊水標(biāo)本由中山大學(xué)達安基因診斷中心提供。未受精卵、卵裂球來自本所生殖中心實驗室。

1.2 主要儀器和試劑

主要儀器有熒光顯微鏡。主要試劑采用荷蘭Kreatech混合探針，由廣東友寧貿(mào)易有限公司提供(雙色，X，21)。2l號和X染色體檢測探針為位點特異性探針，分別用紅色和綠色標(biāo)記。其他試劑:①20×SSC:氯化鈉175g，檸檬酸三鈉88.2g，加三蒸水到1 000ml。②變性液:甲酰胺 28ml，20 × SSC 4ml，蒸餾水8ml，終體積40ml，充分混勻，調(diào)整pH至7.0～8.0，密封保存于4～8℃，每次使用前均需測定pH值。③洗脫液:甲酰胺20ml，20×SSC 4ml，蒸餾水16ml，終體積 40ml。④SSCT:20 × SSC 100ml，Tween－20 0.2ml，加雙蒸水至終體積為 1 000ml。

1.3 標(biāo)本收集

1.3.1 外周靜脈血 外周血直接涂片，封片，備用;外周血淋巴細胞和羊水細胞培養(yǎng)及核型分析，按標(biāo)準(zhǔn)方法進行。

1.3.2 羊水 抽取羊水 5～6ml，1 500 rpm 離心10min，去上清，留羊水細胞沉淀，在細胞沉淀中加3ml 0.25%trypsin(溶于無 CaCl2的 Hanks液)，37℃消化30min;2 000rpm離心10min，去上清，在沉淀中加入 4 ～5ml 0.75mol/L KCl，37℃孵育 30min;加入1ml固定液(甲醇∶冰醋酸為3∶1)，輕輕混勻，2 000rpm離心10min，去上清;加5ml固定液，輕輕混勻，2 000rpm離心10min，去上清;加適量固定液，混勻靜置10min，滴片。滴好的玻片浸泡在37℃的2×SSC液30min，取出浸泡在37℃的0.005%胃蛋白酶15min，然后在室溫依次用70%、85%、100%的酒精脫水各2min，風(fēng)干，加探針混合液，用封片膠封片，變性，雜交過夜。

1.4 標(biāo)本處理

1.4.1 探針和標(biāo)本共變性 在22mm×22mm區(qū)域內(nèi)加入10μl探針，蓋上蓋玻片，放置于75℃熱臺上5～10min，變性。

1.4.2 雜交 放入37℃的濕盒內(nèi)雜交4～20h。

1.4.3 洗脫 放入室溫1× Wash Buffer II(2×SSC/0.1%Igepal)中浸泡2min，揭開去除蓋玻片;在72℃的1 ×Post－Wash Buffer I(0.4 × SSC/0.3%Igepal)中浸泡2min;在室溫1×Wash－Buffer II(2×SSC/0.1%Igepal)洗液中浸泡 1min;在 70%，85% 和100% 甲醇中浸泡各1 min，室溫晾干;加入15μl復(fù)染液DAPI/Antifade，顯微鏡下觀察。

1.5 未受精卵、卵裂球的FISH

1.5.1 卵子的獲得 接受體外受精－胚胎移植(IVF－ET)技術(shù)治療的患者應(yīng)用控制性超排卵方案后，在常規(guī)B超引導(dǎo)下用17G穿刺針經(jīng)陰道取卵。

1.5.2 卵子、精子的培養(yǎng) 采用Vitorlife公司的系列IVF培養(yǎng)基。卵子在體外培養(yǎng)4～6h(IVF－20培養(yǎng)液)，在含80U Hyaluronidase液中去除卵丘復(fù)合體，將出現(xiàn)第一極體的成熟卵移入Gamete培養(yǎng)液中備用。直接洗滌精液，將分離的精子放置IVF－20培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)備用。

1.5.3 受精與觀察 采用常規(guī)或卵細胞漿內(nèi)單精子注射術(shù)(ICSI)受精，次日觀察。選取未受精卵、卵裂球(2C)固定在載玻片上，按常規(guī)方法處理:加入1ml固定液(甲醇∶冰醋酸為3∶1)固定好的玻片浸泡在37℃的2×SSC液30min，取出，浸泡在37℃含0.005%胃蛋白酶液體內(nèi)15min，然后在室溫下依次用70%、85%、100%酒精脫水各2min，風(fēng)干，加探針混合液，用封片膠封片，變性，雜交過夜。

1.5.4 雜交、洗脫、顯色 如前所述。

2 結(jié)果

2.1 外周血和羊水FISH結(jié)果

應(yīng)用21號和X染色體特異性熒光素標(biāo)記雙色混合探針FISH技術(shù)檢測正常羊水間期細胞作為對照:21號染色體在鏡下顯示為兩個紅色點，X染色體顯示為兩個綠色點，確定核型為正常女性核型(46，XX)，如圖1所示。對25例唐氏綜合征患兒外周血以及10例血清篩查陽性孕婦羊水間期細胞進行FISH檢測:21號染色體在鏡下顯示為三個紅色點，X染色體顯示兩個綠色點，核型為21三體(47，XX，+21)，如圖2所示。該35例標(biāo)本經(jīng)核型分析確證，未出現(xiàn)假陰性和假陽性結(jié)果。

2.2 未受精卵、卵裂球FISH結(jié)果

應(yīng)用21號和X染色體特異性熒光素標(biāo)記雙色混合探針FISH技術(shù)進行單個未受精卵間期細胞的PGD，顯微鏡下觀察的FISH分析雜交信號明顯、清晰、肉眼可辨。21號染色體在鏡下顯示為兩個紅色點，X染色體顯示一個綠色點，確定為異常核型結(jié)構(gòu)(24，X，+21)，結(jié)果如圖3所示。通過對單個卵裂球間期細胞進行PGD，21號染色體在鏡下顯示為兩個紅色點，X染色體顯示兩個綠色點，確定為正常核型結(jié)構(gòu)(46，XX)，結(jié)果如圖4所示。

3 討論

對于染色體異常的診斷，傳統(tǒng)的細胞遺傳學(xué)方法往往采用細胞培養(yǎng)與染色體顯帶分析法。由于該方法是通過羊膜腔穿刺或絨毛膜取樣獲得胎兒來源細胞，經(jīng)體外培養(yǎng)后對處于中期分裂象的染色體進行核型分析，結(jié)果獲取一般需要2周甚至更長時間，而孕婦長時間等待易導(dǎo)致心理上的焦慮和緊張，不利于胎兒的宮內(nèi)發(fā)育［2］。20世紀(jì)90年代以后，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及向各學(xué)科的滲透，出現(xiàn)了一種新的運用分子手段分析染色體異常的方法，即染色體FISH技術(shù)，該技術(shù)不僅可用于中期分裂象，還可在間期細胞顯示雜交信號，尤其適用于那些難以培養(yǎng)成功的各種組織細胞(羊水、絨毛、外周血等)，并且大大縮短了產(chǎn)前診斷的時間。FISH方法是將DNA探針用不同顏色熒光染料標(biāo)記，與固定在玻片上的卵裂球細胞不同染色體雜交后，在熒光顯微鏡下被雜交的部分呈現(xiàn)不同顏色的熒光，從而對染色體異常進行篩查。目前在部分發(fā)達國家已將FISH診斷染色體數(shù)目異常作為了一項常規(guī)手段［3］，國內(nèi)研究人員也進行了很多有益的嘗試［4］。

本研究在參考國內(nèi)外多種方法的基礎(chǔ)上，利用熒光素標(biāo)記的雙色混合探針直接對唐氏綜合征進行FISH分析，并建立了一套穩(wěn)定的FISH方法。經(jīng)過染色體核型確證，具有較高的符合率(100%)，與國外的符合率一致［5，6］。FISH與常規(guī)染色體顯帶分析法相比，有如下優(yōu)點:用材少、快速(24h內(nèi)可出結(jié)果)、不需體外培養(yǎng)、在極短時間內(nèi)可檢測大量細胞;可對分散不好的分裂象做出明確診斷;能分析一部分顯帶染色體技術(shù)不易分辨的異常［7］，如復(fù)雜易位、倒位、微小缺失、復(fù)雜畸變等;敏感性和特異性高［8～11］。因此，F(xiàn)ISH技術(shù)可應(yīng)用于未經(jīng)培養(yǎng)的分裂期和間期細胞中染色體異常的分析。而間期細胞獲得容易，細胞數(shù)量多而使分析的細胞數(shù)目也相應(yīng)的增多，這是FISH技術(shù)最大的優(yōu)勢。由于FISH探針試劑的價格昂貴，極大地限制了它在臨床上的應(yīng)用。本研究中FISH檢測全部采用的Kreatech混合探針，價錢相對比較低廉，節(jié)約了成本。本研究所應(yīng)用的雙色FISH檢測，均未出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果，與傳統(tǒng)的細胞染色體核型分析結(jié)果一致;技術(shù)方法上更簡單、經(jīng)濟，達到了檢測染色體異常的目的。同時，本研究對FISH實驗成本進行了優(yōu)化，在研究過程中嘗試調(diào)整雜交液用量，將雜交液的用量減少，使得同樣的試劑可以應(yīng)用到更多的標(biāo)本上，對雜交效果沒有顯示出影響。研究結(jié)果顯示優(yōu)化的實驗方案提高了快速檢出效能并且明顯降低了成本，為下一步大規(guī)模應(yīng)用于臨床打下基礎(chǔ)。

胚胎PGD是指在體外受精過程中，對具有遺傳風(fēng)險患者的胚胎活檢卵裂胚胎細胞，進行植入前遺傳學(xué)分析，以選擇正常的胚胎移植回母體子宮，獲得正常胎兒的診斷方法，可有效地防止有遺傳疾病的患兒出生［3，12］。PGD 是隨著人類輔助生殖技術(shù)，即IVF－ET技術(shù)發(fā)展而開展起來的一種新技術(shù)，是產(chǎn)前診斷的延伸，是遺傳學(xué)診斷的又一更有應(yīng)用前景的新技術(shù)。對高齡孕婦和高危婦女進行PGD可以有效地避免遺傳病患兒的出生，可對異常胚胎進行治療性流產(chǎn)，避免中期妊娠遺傳診斷及終止妊娠所致的危險及痛苦［13］。PGD可從胚胎著床前各個階段活檢取樣，縮短了產(chǎn)前診斷的時效性，同時也避免了選擇性流產(chǎn)和多次流產(chǎn)可能造成的危害以及與倫理道德觀念的沖突。

通過FISH技術(shù)采用多種探針可診斷男、女性別和性連鎖疾病，也可診斷染色體疾病，包括數(shù)目和結(jié)構(gòu)的畸變［14，15］。所以 FISH 技術(shù)的應(yīng)用擴大了PGD的診斷范圍，特別是間期單核細胞FISH技術(shù)的成功，以及多種多樣FISH探針的開發(fā)，把PGD擴展到了染色體病的診斷。如FISH技術(shù)在PGD中的應(yīng)用解決了胚胎性別的鑒定，排除性連鎖疾病的發(fā)生。如對于X連鎖隱性遺傳病，通過FISH技術(shù)鑒定性別，防止后代相應(yīng)遺傳病的發(fā)生。同時，通過選擇正常和平衡配子或胚胎，PGD可顯著降低染色體易位導(dǎo)致的反復(fù)自然流產(chǎn)率，這是其他產(chǎn)前診斷無法比擬的。本研究探討FISH方法，對未成熟卵、未受精卵進行FISH雜交，結(jié)果與染色體核型分析一致，獲得良好的結(jié)果。如采用單細胞快速制備中期染色體的方法，結(jié)合多種FISH技術(shù)，如多重雜交FISH技術(shù)、光譜核型分析、比較基因組雜交等，將大大地提高PGD檢測的準(zhǔn)確性和有效性。因此，F(xiàn)ISH技術(shù)對于產(chǎn)前診斷唐氏綜合征及PGD，具有重要的臨床應(yīng)用價值，是一種有前景的遺傳病產(chǎn)前診斷方法。

1 Ye WH，Zhao SY，Li P，et al.Modern Clinical Genetics［J］.Hefei:Scientific and Technological Publisher of Anhui，1996，27(5):368－378.

2 蔣雯婷，龍飛，倪琳，等.熒光原位雜交在染色體異常產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用研究［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2010.30(5):604－608.

3 Eckmann－Scholz C，Gesk S，Nagel I.Conflicting results of prenatal FISH with different probes for Down＇s Syndrome critical regions associated with mosaicism for a de novo del(21)(q22)characterised by molecular karyotyping:Case report［J］.Mol Cytogenet，2010，16(3):1－5.

4 Wang H，Li H，et al.Rapid prenatal diagnosis of chromosome aneuploidies in 60 uncultured amniotic fluid samples by fluorescence in situ hybridization［J］.Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi，2008，25(5):538－541.

5 Evans MI，Sharp M，Tepperberg J，et al.Automated microscopy of anmiotic fluid cells:detection of FISH signals using tlle Fast FISH imaging system［J］.Fetal Diagn Ther，2006，21:523－527.

6 Lev D，Daniely M，Zudik A，et al.Automatic scanning of interphase FISH for prenatal diagnosis in uncultured amniocytes［J］.Genet Test，2005，9(5):41－47.

7 偶健，陳瑛，張俊，等.熒光原位雜交和染色體涂染技術(shù)在G帶核型分析不明病例中的應(yīng)用［J］.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2009.26(2):233－235.

8 Witters I，Devrienclt K，Legius E.Rapid prenatal diagnosis of trisomy 21 in 5049 consecutive uncultured a mniotic fluid samples by fluorescence in situ hybridization(FISH)［J］.Prenat Diagn，2002，22(1):29－33.

9 Toth A，Tardy E P，Hajdu K.Fluorescence in situ hybridization of chorionic interphase cells for prenatal screening of Down syndrome［J］.Eur J Obstet Gynecol Reprod，2001，94(1):262－269.

10 王樹玉，黃醒華，賈嬋維，等.國產(chǎn)探針熒光原位雜交技術(shù)用于產(chǎn)前診斷未培養(yǎng)羊水細胞染色體異常的研究［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2009，44(7):492－495.

11 Laczma ska I，Stembalska A，Slezak R，et al.Rapid－FISH－fast and reliable method of detecting common numerical chromosomal aberrations in prenatal diagnosis［J］.Ginekol Pol，2007，78(12):952－955.

12 藍海蓮，沈珺，張莉.胚胎植入前遺傳學(xué)診斷的知情同意情況分析［J］.浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)，2010，22(5):70－71.

13 Weise A，Liehr T.Rapid prenatal aneuploidy screening by fluorescence in situ hybridization(FISH)［J］.Methods Mol Biol，2008，44(4):39－47.

14 徐艷文.胚胎植入前遺傳學(xué)診斷技術(shù)的挑戰(zhàn)［J］.中國實用婦科與產(chǎn)科雜志，2010，26(10):768－772.

15 Altarescu G，Reish O，Renbaum P.Preimplantation genetic diagnosis(PGD)for SHOX－related haploinsufficiency in conjunction with trisomy 21 detection by molecular analysis［J］.J Assist Reprod Genet，2010，28(3):233－238.