傅晨 張?jiān)蕩X 常富業(yè) 劉雪梅 王新祥 鄭宏 陶冶 閆妍 黃啟福

腦出血是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康和生命的疾病，因其起病急、進(jìn)展快、病死率高而備受關(guān)注。腦出血后腦水腫可引起顱內(nèi)壓增高，在導(dǎo)致死亡和殘疾的諸多因素中起著重要作用。近年來(lái)的研究證實(shí)腦出血后的炎癥反應(yīng)能促進(jìn)腦水腫，加重神經(jīng)元的損害，是腦出血后產(chǎn)生腦水腫的病理機(jī)制之一。而內(nèi)毒素血癥是腦出血引起全身感染和全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic infla--mmatory response syndrome，SIRS)的重要原因之一[1]。

本課題組前期成功制作大鼠腦出血模型，結(jié)果表明，模型組大鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損，且出血局部腦組織存在病理形態(tài)損傷；而具有開(kāi)通玄府、利水解毒作用的中藥復(fù)方利開(kāi)靈對(duì)此有明顯改善作用[2]。本研究制備的腦出血大鼠模型體內(nèi)發(fā)生了內(nèi)毒素血癥。為深入研究利開(kāi)靈拮抗腦出血后腦水腫的作用機(jī)制，本研究觀察了腦出血后內(nèi)毒素血癥的炎癥效應(yīng)，并探討利開(kāi)靈對(duì)其影響。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性清潔級(jí)Sprague Dawley(SD)大鼠156只，體重(250±20)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。利開(kāi)靈復(fù)方(組成：澤瀉30 g、石菖蒲15 g、半邊蓮30 g、桂枝10 g)由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心水煎濃縮；Ⅳ型膠原酶(Collagenase Ⅳ，Sigma C5138)，顯色基質(zhì)鱟試劑盒(廈門(mén)鱟試劑廠)，大鼠血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α) ELISA試劑盒(R&D公司)，大鼠血清白細(xì)胞介素-1β(IL-1β) ELISA試劑盒(R&D公司)，碘[125I]TNF-α放射免疫試劑盒(解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放免所)，碘[125I]IL-1β放射免疫試劑盒(解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放免所)，無(wú)熱原耗材均由廈門(mén)鱟試劑廠提供。

1.2 儀器

大鼠腦立體定位儀(Stoelting Model310)，微量進(jìn)樣器(Stoelting)，濕式二氧化碳培養(yǎng)箱(SHELL/JB TC2323)，微量振蕩器(姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司)，酶標(biāo)儀(BIO-TEK ELX800)，免疫計(jì)數(shù)器(上海核所日環(huán)光電儀器有限公司，Sn-695B)。

1.3 方法

1.3.1 分組與給藥 根據(jù)腦出血的不同時(shí)間點(diǎn)(12、24、48、72小時(shí))，將SD大鼠隨機(jī)分為4組，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)再分為3組：假手術(shù)組、模型組、利開(kāi)靈組，共12組，每組13只。上述各組造模蘇醒后，利開(kāi)靈組立即給予利開(kāi)靈濃煎劑灌胃，后每隔12小時(shí)給藥一次。假手術(shù)組、模型組給藥時(shí)間及給藥途徑同利開(kāi)靈組，以等量蒸餾水代替藥液。給藥劑量根據(jù)人與大鼠體表面積公式換算，每公斤體重大鼠每日給利開(kāi)靈生藥7.7 g，再以每日給藥2次，每次每只大鼠給藥3 ml核算出藥物濃度。

1.3.2 模型建立 采用Rosenberg法[3]改良后建立大鼠腦出血模型，同本課題組前期實(shí)驗(yàn)造模方法[2]。造模后，按Bederson評(píng)分法[4]進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。評(píng)分在1～4分的大鼠為模型制作成功，納入實(shí)驗(yàn)分組；將出血較多，提前死亡，取腦時(shí)發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血以及術(shù)后存活時(shí)間未達(dá)取材時(shí)間要求的大鼠剔除。

1.3.3 內(nèi)毒素水平檢測(cè) 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)麻醉，腹主動(dòng)脈取血，抗凝，離心，在超凈工作臺(tái)內(nèi)分離血漿，放入專(zhuān)用無(wú)熱原試管內(nèi)，-80℃保存?zhèn)溆?，集中檢測(cè)內(nèi)毒素脂多糖(LPS)，嚴(yán)格按照顯色基質(zhì)鱟試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.4 TNF-α、IL-1β水平檢測(cè) 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)麻醉，腹主動(dòng)脈取血，離心取血清，-80℃保存?zhèn)溆?；然后斷頭，迅速取大鼠患側(cè)腦注射針孔前后各約1 mm，共約2 mm的腦組織，以滅菌錫箔紙包裹，置于液氮中冷凍后移至-80℃保存。血清TNF-α、IL-1β檢測(cè)按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，出血局部腦組織TNF-α、IL-1β檢測(cè)按照放免試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 利開(kāi)靈對(duì)腦出血大鼠血漿內(nèi)毒素水平的影響

模型組內(nèi)毒素均明顯高于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組(P<0.01)，呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，在48 小時(shí)達(dá)高峰。利開(kāi)靈組內(nèi)毒素在12 小時(shí)升高(P<0.01)，且與模型組無(wú)顯著差異，其后其表達(dá)呈下降趨勢(shì)，48 小時(shí)和72 小時(shí)均明顯低于模型組(P<0.01)，于72 小時(shí)為最低，且與假手術(shù)組無(wú)顯著差異，見(jiàn)表1。

2.2 利開(kāi)靈對(duì)腦出血大鼠血清TNF-α、IL-1β水平的影響

模型組大鼠TNF-α在各時(shí)間點(diǎn)均明顯高于假手術(shù)組，在24 小時(shí)達(dá)高峰(P<0.01)；利開(kāi)靈組TNF-α在12 小時(shí)升高(P<0.05)，24 小時(shí)仍明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)，但低于模型組(P<0.01)，48 小時(shí)和72 小時(shí)均低于模型組(P<0.05，P<0.01)，且與假手術(shù)組無(wú)顯著差異，見(jiàn)表2。

模型組血清IL-1β呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，24 小時(shí)達(dá)高峰(P<0.01)，72小時(shí)接近假手術(shù)組基礎(chǔ)值水平；利開(kāi)靈組在12 小時(shí)即有升高趨勢(shì)，24 小時(shí)明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，仍低于模型組，48 小時(shí)和72 小時(shí)與假手術(shù)組比較無(wú)顯著差異，見(jiàn)表3。

2.3 利開(kāi)靈對(duì)腦出血大鼠出血局部腦組織TNF-α、IL-1β水平的影響

模型組TNF-α于12小時(shí)開(kāi)始升高(P<0.05)，其后均明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)，呈升高趨勢(shì)直至72小時(shí)；利開(kāi)靈組TNF-α在12 小時(shí)即有升高趨勢(shì)， 24 小時(shí)稍下降，明顯低于模型組(P<0.01)，48 小時(shí)再次升高，但仍低于模型組(P<0.05)，72 小時(shí)達(dá)最高，仍低于模型組，與模型組、假手術(shù)組比較均有顯著差異(P<0.01)，見(jiàn)表4。

模型組IL-1β各時(shí)間點(diǎn)均高于假手術(shù)組，呈先升高再下降的趨勢(shì)，在48 小時(shí)達(dá)最高(P<0.01)；利開(kāi)靈組IL-1β在12 小時(shí)即升高，24 小時(shí)下降，明顯低于模型組(P<0.01)，48 小時(shí)再次升高，但仍低于模型組(P<0.01)，72 小時(shí)明顯低于模型組(P<0.05)，且與假手術(shù)組比較無(wú)顯著差異，見(jiàn)表5。

表1 腦出血不同時(shí)點(diǎn)大鼠血漿內(nèi)毒素水平動(dòng)態(tài)變化及利開(kāi)靈的影響

表2 腦出血不同時(shí)點(diǎn)大鼠血清TNF-α水平動(dòng)態(tài)變化及利開(kāi)靈的影響

表3 腦出血不同時(shí)點(diǎn)大鼠血清IL-1β水平動(dòng)態(tài)變化及利開(kāi)靈的影響

表4 大鼠出血局部腦組織不同時(shí)點(diǎn)TNF-α水平動(dòng)態(tài)變化及利開(kāi)靈的影響

表5 大鼠出血局部腦組織不同時(shí)點(diǎn)IL-1β水平動(dòng)態(tài)變化及利開(kāi)靈的影響

3 討論

近幾年來(lái)，隨著對(duì)腦出血損傷機(jī)理研究的深入，腦組織已經(jīng)被證實(shí)并非完全是免疫豁免區(qū)，腦出血后腦組織同樣產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。炎癥細(xì)胞產(chǎn)生的各種酶及炎癥細(xì)胞因子，可通過(guò)加重血腦屏障的破壞和細(xì)胞膜的損傷，產(chǎn)生和加重血管源性及細(xì)胞毒性腦水腫[5]。Castillo等[6]發(fā)現(xiàn)，腦出血患者發(fā)病后3～4天內(nèi)血腫周?chē)[程度與出血后24小時(shí)內(nèi)TNF-α水平呈顯著正相關(guān)。Mayne等[7]發(fā)現(xiàn)，腦出血時(shí)TNF-α能促進(jìn)炎性反應(yīng)發(fā)生，加重腦水腫，而TNF-α特異性反義脫氧寡核苷酸(ORF4-PE)能抑制TNF-α的表達(dá)，具有神經(jīng)保護(hù)作用。Kimelberg[8]發(fā)現(xiàn)，腦室內(nèi)注入IL-1β可加重腦水腫特別是星形膠質(zhì)細(xì)胞的腫脹和變形，繼而釋放各種神經(jīng)毒性因子加重血腦屏障破壞和細(xì)胞膜的損傷，促進(jìn)和加重血管源性及細(xì)胞毒性腦水腫。因此，深入認(rèn)識(shí)影響腦出血后腦部炎癥反應(yīng)的病理因素，對(duì)防治腦出血后腦水腫有著重要意義。

在多種危重的病理過(guò)程中伴發(fā)的內(nèi)毒素血癥可以誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征[9]。內(nèi)毒素血癥的核心內(nèi)毒素(LPS)在體內(nèi)的作用錯(cuò)綜復(fù)雜，主要通過(guò)LPS與細(xì)胞表面的受體結(jié)合后產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，活化細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，促進(jìn)細(xì)胞合成、釋放各種細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)，包括TNF-α、白介素-1、白三烯、血小板激活因子等，從而導(dǎo)致體內(nèi)異常的炎性反應(yīng)。本研究血漿內(nèi)毒素測(cè)定證實(shí)了腦出血后內(nèi)毒素血癥的存在，而血漿內(nèi)毒素高峰時(shí)間與血清炎癥因子表達(dá)高峰時(shí)間不一致，這可能的原因是:研究已發(fā)現(xiàn)腦出血后機(jī)體既存在促炎機(jī)制，也存在抗炎機(jī)制，二者共同調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥反應(yīng)[10]，共同對(duì)炎癥細(xì)胞釋放TNF-α、IL-1β等細(xì)胞因子產(chǎn)生影響。

正常情況下，血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)只允許某些分子量小于2000kd的物質(zhì)經(jīng)過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接處入腦，而腦出血后存在BBB損傷，同時(shí)LPS刺激也可造成BBB損傷，從而導(dǎo)致其通透性增加[11]。本研究腦出血大鼠血漿LPS、血清TNF-α、IL-1β含量明顯升高，三者可能通過(guò)受損的BBB進(jìn)入腦內(nèi)：一方面，LPS進(jìn)入腦組織后可促進(jìn)腦內(nèi)炎癥細(xì)胞因子的釋放；另一方面，血清炎癥因子可能直接激化損傷部位的腦組織炎癥反應(yīng)。這兩個(gè)方面共同作用對(duì)腦組織TNF-α、IL-1β含量變化產(chǎn)生影響。本研究表明，模型組出血局部腦組織TNF-α、IL-1β均呈升高趨勢(shì)直至48小時(shí)，結(jié)合血LPS、TNF-α、IL-1β的表達(dá)變化推測(cè)，出血局部腦組織TNF-α、IL-1β水平可能在腦出血后24小時(shí)內(nèi)受二者共同影響，24小時(shí)后可能主要受內(nèi)毒素水平影響。而出血局部腦組織TNF-α和IL-1β在48小時(shí)后表達(dá)變化趨勢(shì)不一致，其可能原因是：內(nèi)毒素途徑可能存在著影響TNF-α、IL-1β合成、釋放的不同機(jī)制，從而使二者表達(dá)高峰不一致。這需要進(jìn)一步的深入研究探討。

利開(kāi)靈復(fù)方由澤瀉、石菖蒲、半邊蓮、桂枝組成，具有開(kāi)通玄府、利水解毒的作用。臨床研究表明利開(kāi)靈可改善腦出血患者的臨床癥狀與體征及實(shí)驗(yàn)室多項(xiàng)指標(biāo)，效果滿(mǎn)意[12]；實(shí)驗(yàn)研究亦發(fā)現(xiàn)，利開(kāi)靈降低腦組織含水量，對(duì)腦出血后腦水腫有可靠的干預(yù)效應(yīng)[13]。本研究采用利開(kāi)靈對(duì)腦出血后大鼠進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)其降低了血漿內(nèi)毒素水平，對(duì)內(nèi)毒素引發(fā)的炎癥因子的合成、釋放起到了控制作用，并干預(yù)了腦TNF-α、IL-1β的表達(dá)水平，提示利開(kāi)靈對(duì)內(nèi)毒素血癥炎癥效應(yīng)有較好的調(diào)控作用，其機(jī)制可能有以下幾個(gè)方面：利開(kāi)靈通過(guò)“開(kāi)通玄府”調(diào)暢玄府氣機(jī)，改善全身代謝狀態(tài)，降低血腦屏障通透性，減少血液中內(nèi)毒素、炎癥因子對(duì)腦的影響；降低腸黏膜通透性，并增強(qiáng)胃腸道運(yùn)動(dòng)，使腸道積滯排出，減少了腸源性?xún)?nèi)毒素的產(chǎn)生和吸收；并下調(diào)炎癥細(xì)胞活性，減少TNF-α、IL-1β等炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放。這可能是利開(kāi)靈明顯改善腦出血后腦水腫的作用機(jī)制之一。

[1] 屈傳強(qiáng)，麻琳，郭洪志,等.急性腦出血致腦源性多器官功能障礙綜合征模型IL-1β的基因表達(dá)及與血清內(nèi)毒素的相關(guān)性研究[J]．山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2007，45(4)：353-356.

[2] 傅晨，張?jiān)蕩X，常富業(yè)，等. 利開(kāi)靈對(duì)腦出血大鼠腦組織CD14、TLR4mRNA表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2011,26(5)：930-934.

[3] Rosenberg GA，Mun-Bryce S，Wesley M,et al.Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats[J].Stroke，1990，21(5):801-807.

[4] Bederson JB,Pittd LH,Tsuji M,et al. Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurological examination[J]. Stroke,1986,17(3):472-476.

[5] 喻明. 腦出血血腫周?chē)难装Y反應(yīng)機(jī)制及其損傷作用[J]. 醫(yī)學(xué)綜述，2005，11(10)：913-915.

[6] Castillo J,Dávalos A,Alvarez-Sabín J,et al.Molecular signatures of brain injury after intracerebral hemorrhage[J].Neurology,2002,58(4):624-629.

[7] Mayne M,Ni W,Yan HJ,et al.Antisense oligodeoxynucleotide inhibition of tumor necrosis factor2alpha expression is neuroprotective after intracerebral hemorrhage[J].Stroke,2001,32(1):240-248.

[8] Kimelberg HK.Current concepts of brain edema.Review of laboratory investi- gations[J]. J Neurosurg, 1995, 83(6):1051-1059.

[9] Doig CJ，Sutherland LR，Sandham JD，et al.Increased intestinal permeability is associated with the development of multiple organ dysfunction syndrome in critically ill ICU patients[J]. Am J Respir Crit Care Med，1998，158(2):444-451.

[10] Dziedzic T，Bartus S，Klimkowicz A，et al.Intracerebral hemorrhage triggers interleukin-6 and interleukin-10 release in blood[J].Stroke，2002，33(9):2334-2335.

[11] 彭鏡，尹飛，甘娜,等.內(nèi)毒素脂多糖對(duì)體外血腦屏障模型通透性的影響及其機(jī)制研究[J]．中華醫(yī)學(xué)雜志，2006，86(27)：1924-1926．

[12] 常富業(yè)，王永炎，楊寶琴，等.利開(kāi)靈治療急性腦出血臨床研究[J].中國(guó)中醫(yī)急癥,2005,14(5):393-394.

[13] 常富業(yè)，王永炎，高穎，等.開(kāi)通玄府對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性腦出血腦水腫的效應(yīng)研究[J].中醫(yī)藥學(xué)刊,2005,23(10):1784-1787.