李發(fā)玲, 李景富, 康立功, 張 賀, 許向陽

(東北農(nóng)業(yè)大學園藝系,哈爾濱 150030)

番茄枯萎病是番茄生產(chǎn)特別是保護地栽培的重要病害之一,是番茄生產(chǎn)中一個重要的限制性因素。由于枯萎病是土傳性病害,其病菌抗逆性強,藥劑防治效果不理想。因此,選育和利用抗病品種是番茄枯萎病的主要防治方法。

早在1940年,人們就發(fā)現(xiàn)番茄枯萎病病菌有生理小種分化,并存在2個生理小種[1-3]。枯萎病是由顯性單基因控制[4]。通過F.o.lycopersici和栽培番茄的相互作用,目前已發(fā)現(xiàn)有3個不同的抗病基因[3-7],分別為 I-1、I-2、I-3。抗生理小種1的基因為I-1;抗生理小種2的基因為I-2;對生理小種1和生理小種2都具有抗性的基因為 I-3。目前,對I-2、I-3基因的研究較深入,I-2已進行到克隆階段[8],I-3基因已被 RFLP[9]、AFLP[10]、SCAR[11]、CAPS[12]等技術(shù)精確作圖。但對I-1基因的研究不夠深入,Bohn[13],Paddock[14]把 I-1基因定位到第11條染色體上,而Sarfatti[15]把I-1基因定位到第7條染色體上。

在分子標記技術(shù)中,AFLP技術(shù)和SSR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基因的分子標記、定位、遺傳圖譜構(gòu)建等方面。與其他技術(shù)相比,AFLP技術(shù)多態(tài)性豐富、DNA用量少檢測效率高、不受環(huán)境影響、無復(fù)等位效應(yīng)、帶紋豐富、無需預(yù)知基因組的序列信息;SSR技術(shù)多態(tài)性高、重復(fù)性好、具有共顯性、操作簡單。本研究利用AFLP技術(shù)和SSR技術(shù),篩選與番茄枯萎病抗病基因I-1連鎖的AFLP標記和SSR標記,為加快番茄抗枯萎病育種、豐富番茄遺傳圖譜和番茄分子標記輔助育種提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 番茄材料

本試驗以抗枯萎病品種‘05045'(含I-1基因)為母本,感病品種‘051451'為父本,配制雜交組合獲得F1代,通過在海南島加代獲得F2代。上述材料均由東北農(nóng)業(yè)大學園藝系番茄課題組提供。

1.1.2 番茄枯萎病菌

番茄枯萎病菌屬生理小種1,由東北農(nóng)業(yè)大學園藝系番茄課題組提供。

1.1.3 試劑

試驗所用的AFLP接頭、AFLP引物、SSR引物均由上海生工生物工程公司合成,RNase、Taq聚合酶、MseI、EcoRI、T4連接酶均為美國 MBI公司產(chǎn)品,dNTP為 TaKaRa公司產(chǎn)品,其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 番茄枯萎病抗性鑒定

把在PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)了7 d的番茄枯萎病病菌制備成分生孢子含量為107個/mL的菌懸液,采用浸根法結(jié)合注射法,在F2代群體1～2片真葉時接種,遮光處理1周,25 d后調(diào)查并記錄發(fā)病情況。將F2代群體分為抗病和感病兩類。

1.2.2 葉片總DNA的提取

在發(fā)病高峰期分別取抗病和感病各20株幼嫩葉片,采用改良的CTAB法[16]提取葉片DNA,用于構(gòu)建抗感池。再取各F2單株幼嫩葉片,提取DNA,用于選擇性擴增。用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測DNA質(zhì)量和濃度。

1.2.3 AFLP標記

AFLP標記參照 Vos的方法[17]。酶切采用EcoRⅠ/MseⅠ雙酶切;預(yù)擴增引物采用 E00和M00;選擇性擴增采用E引物和M引物組合的870對引物。PCR產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測,80W恒功率電泳2h,銀染后觀察。

1.2.4 SSR標記

SSR標記參照優(yōu)化的SSR體系[18]。采用319對引物。PCR產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測,75W恒功率電泳1h,銀染后觀察。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及連鎖距離分析

利用χ2檢驗分析AFLP、SSR多態(tài)性標記與抗病和感病植株的性狀分離情況。應(yīng)用Map Maker 3.0軟件計算連鎖遺傳距離,臨界LOD值取3.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗病性鑒定結(jié)果

對F2代群體的348個單株進行了番茄枯萎病抗病性鑒定,其中抗病259株,感病89株。χ2=0.113,符合顯性單基因的遺傳規(guī)律。

2.2 AFLP標記

2.2.1 引物篩選

用父母本‘051451'和‘05045'對870對選擇性擴增引物進行篩選。篩出差異引物392對,篩出差異性較好的引物51對。在抗感池中對篩選出的51對多態(tài)性較好的引物進行復(fù)選,篩出24對差異性多和多態(tài)性好的引物。(見表1)

表1 篩出的24對差異性好的AFLP特異引物

2.2.2 F2單株P(guān)CR擴增

利用篩選出的24條引物對348株F2代群體進行擴增。利用MapMaker3.0軟件進行連鎖分析,結(jié)果表明：E41M60-D(280 bp)、E41M62-C(310 bp)、E86M36-B(420 bp)和E32M44-E(120 bp),與抗病基因I-1的連鎖遺傳距離分別為4.7、5.3、8.9、11.5cM。其中E41M60-D見圖1,其余圖片略。

2.2 SSR標記

2.2.1 引物篩選

用父母本‘051451'和‘05045'對 319對 SSR引物進行篩選。篩出父母間差異好的引物25對。然后在基因池中進行復(fù)選,篩出16對差異顯著且穩(wěn)定的引物(見表2)。

圖1 引物E41M60在部分F2單株中的擴增結(jié)果

表2 篩出的16對差異性好的SSR特異引物

2.2.2 F2單株P(guān)CR擴增

用篩選出的16條引物對348株F2代群體進行擴增。利用MapMaker 3.0軟件進行連鎖分析,結(jié)果表明：SSR108(如圖 2)、SSR276(圖略)與抗病基因I-1的連鎖遺傳距離分別為6.1、9.3cM。

圖2 引物SSR108在部分F2單株中的擴增結(jié)果

3 討論

番茄枯萎病是土傳性病害,病菌長年累積發(fā)病才充分,而在試驗條件下充分發(fā)病是一大難題。本研究采用浸根法結(jié)合注射法,在浸根20 min后,再注入0.5 mL的菌懸液,以保證充分發(fā)病。將兩種常規(guī)的方法結(jié)合起來,使鑒定效率更高。

本研究所得到的 AFLP標記 E41M60-D與抗病基因I-1的連鎖遺傳距離為4.7cM,為該基因定位和克隆、在番茄苗期開展抗性鑒定及番茄枯萎病的遺傳學研究奠定了基礎(chǔ)。番茄枯萎病病菌生理小種1在我國是優(yōu)勢小種,因此本研究所得到的標記對開展番茄枯萎病抗病育種具有重要實踐意義。但由于親本之間親緣關(guān)系較近、某些DNA的降解導致聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染后條帶不清晰、不同批號的無水碳酸鈉對染色深淺的影響從而影響數(shù)據(jù)統(tǒng)計等誤差,影響了遺傳距離的準確性。因此,下一步可以利用新一代的操作更簡單、更準確的分子標記技術(shù)尋找更加緊密連鎖的標記。

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