李 玲, 樊 東, 吳麗梅, 姚 磊

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,哈爾濱 150030)

幾丁質(zhì)(chitin)又稱甲殼素、甲殼質(zhì)等,是由N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)單體通過β-1,4糖苷鍵連接而成的直鏈高分子化合物。在自然界中,幾丁質(zhì)存在于真菌及藻類的細(xì)胞壁、無脊椎動(dòng)物的外骨骼及表皮中,幾丁質(zhì)是自然界中最豐富的天然有機(jī)化合物之一,其數(shù)量?jī)H次于纖維素[1-2]。研究證明,幾丁質(zhì)是昆蟲表皮和圍食膜的重要組成成分,昆蟲生長(zhǎng)、發(fā)育的各個(gè)時(shí)期都需要一定量的幾丁質(zhì)[3]。幾丁質(zhì)代謝隨昆蟲不同生長(zhǎng)發(fā)育階段而變化,對(duì)昆蟲的正常生長(zhǎng)發(fā)育是至關(guān)重要的。而高等植物和高等動(dòng)物體內(nèi)則不含幾丁質(zhì),因此,通過破壞幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)或幾丁質(zhì)代謝的平衡來防治害蟲,具有極大的發(fā)展?jié)摿4]。

幾丁質(zhì)脫乙?；?chitin deacetylase,EC3.5.1.41),簡(jiǎn)稱CDA。CDA 來源廣泛,如真菌、酵母和昆蟲等都發(fā)現(xiàn)CDA的存在,是幾丁質(zhì)降解酶系成員之一,能夠催化幾丁質(zhì)中β-1,4糖苷鍵連接的N-乙?；咸前返囊阴０坊乃鈁5]。CDA最初是從真菌毛霉(Mucor rouxii)分離純化的一種乙酰基轉(zhuǎn)移酶[6]。真菌的幾丁質(zhì)脫乙酰基酶主要參與真菌細(xì)胞壁的形成[7],且與真菌自溶過程中的細(xì)胞壁裂解有關(guān)[8];CDA還參與植物和病原微生物的相互作用[1]。昆蟲中對(duì) CDA研究落后于真菌和細(xì)菌且CDA在昆蟲中的功能還不十分明確,目前人們已克隆了粉紋夜蛾、棉鈴蟲等幾種昆蟲的CDA基因并對(duì)其活性和功能進(jìn)行了初步研究[9-10]。

苜蓿實(shí)夜蛾[Heliothis viriplaca(Hüfnagel)],屬鱗翅目夜蛾科害蟲,近年間歇性暴發(fā)成災(zāi),已成為主要的農(nóng)業(yè)害蟲之一。苜蓿實(shí)夜蛾以幼蟲直接為害大豆、亞麻、苜蓿、玉米、棉花、花生等多種農(nóng)作物和牧草。幼蟲取食植物葉片或幼嫩組織,嚴(yán)重時(shí)造成植株光稈,大齡幼蟲還可蛀莢蛀果,造成減產(chǎn)和產(chǎn)品品質(zhì)下降。從分子水平研究其生長(zhǎng)發(fā)育等生物學(xué)過程對(duì)于該蟲的防治具有重要意義。作者采用RT-PCR和cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù),以苜蓿實(shí)夜蛾為材料,克隆幾丁質(zhì)脫乙?；富虻腸DNA序列并對(duì)其編碼氨基酸序列進(jìn)行分析,為從分子水平上研究幾丁質(zhì)脫乙?；傅墓δ堋锥≠|(zhì)的代謝機(jī)制及生物防治新方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 昆蟲材料、菌株、質(zhì)粒與試劑

利用黑光燈在田間誘集苜蓿實(shí)夜蛾成蟲,室內(nèi)飼以5%蜂蜜水使其產(chǎn)卵并用新鮮大豆葉做飼料喂養(yǎng)到5齡幼蟲備用;RNA提取試劑盒TRIzol·Reagent為Invitrogen公司產(chǎn)品、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV Reverse Transcriptase、克隆載體pGEM-T easy Vector、低熔點(diǎn)瓊脂糖購(gòu)自Promega公司;DNA膠回收試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司;Taq plus DNA聚合酶為上海生工生物工程公司產(chǎn)品,受體菌JM 109由本實(shí)驗(yàn)室保存,其余試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 昆蟲總RNA的提取

苜蓿實(shí)夜蛾總 RNA的提取參照RNA提取試劑盒說明,提取的總RNA放入-86℃冰箱中備用。

1.3 利用RT-PCR技術(shù)克隆基因cDNA序列片段

比較棉鈴蟲(H.armigera)(GenBank登錄號(hào)EU325568)、小地老虎(Agrotis ipsilon)(GenBank登錄號(hào)為FJ899541)2種昆蟲幾丁質(zhì)脫乙?；富虻腸DNA序列,根據(jù)相同序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物:HvCDA:5′-TAC ACA ATG TAC TTC AGA ATG CC-3′和 AntiHvCDA-5′-ACG CACGTC TGC AGG TTG ATG GT-3′。 以 Oligo(dt)3site adapter primer:5′-GAC TCG AGT CGA CAT CGA(T)17-3′為 cDNA 合成引物,利用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV Reverse Transcriptase合成第1鏈cDNA,具體參照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶使用說明。以合成的cDNA為模板,以HvCDA和AntiH-vCDA為引物擴(kuò)增幾丁質(zhì)脫乙?；竎DNA序列的特異片段。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min;94℃,30 s;58℃,1 min;72℃,2 min,30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物回收,與 pGEM-T easy vector連接、轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定。連接正確的重組子由上海生工生物工程公司進(jìn)行序列測(cè)定?？寺〉玫降腸DNA的部分序列,用以設(shè)計(jì)5′和 3′RACE引物,克隆cDNA的全長(zhǎng)序列。

1.4 利用RACE技術(shù)克隆cDNA全長(zhǎng)序列

根據(jù)得到的cDNA片段設(shè)計(jì)克隆基因3′端的上游引 物 HvCDA 1-5′-CGA ACT AGA CCG TCG TGA GGA-3′。 利 用 HvCDA 、HvCDA1 和 3 site adapter primer:5′-GAC TCG AGT CGA CAT CGA-3′通過巢式PCR擴(kuò)增基因的3′端,方法同上。

根據(jù)得到的cDNA片段設(shè)計(jì)2個(gè)克隆基因5′RACE的下游引物:Hv inner:5′-TGG CAA CGG TGA GGC ATT CTG AAG TAC ATA GTG T-3′;Hvinner outer:5′-GCA GCG TGG AAG TAG AGA CCT AA-3′,具體方法按照寶生物 5′RACE試劑盒說明進(jìn)行。

1.5 序列分析

利用CLONE軟件對(duì)獲得的cDNA序列進(jìn)行翻譯,推導(dǎo)得到氨基酸序列。利用ExPASy網(wǎng)站(http:∥ca.expasy.org/tools/)的Compute pI/Mw蛋白分析軟件推導(dǎo)氨基酸序列的分子量、等電點(diǎn);SignalP 3.0 Server進(jìn)行信號(hào)肽的預(yù)測(cè);采用NCBI中conserved domain軟件預(yù)測(cè)氨基酸序列中的功能區(qū);利用DNAMAN和BOXSHADE3.21軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析,氨基酸序列來自于NCBI中的通過blast(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)軟件搜索得到的與克隆基因氨基酸序列一致性較高的序列以及正式發(fā)表的CDA文章中的序列,一致性百分?jǐn)?shù)計(jì)算利用blastp獲得。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿實(shí)夜蛾幾丁質(zhì)脫乙酰基酶基因cDNA序列的獲得

利用RT-PCR和RACE技術(shù)擴(kuò)增出苜蓿實(shí)夜蛾幾丁質(zhì)脫乙?；富騝DNA全長(zhǎng)序列,得到的cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列在GenBank上用Blast軟件搜索,找到一致性較高的序列均為昆蟲幾丁質(zhì)脫乙?；竎DNA或氨基酸序列,該cDNA序列已經(jīng)登錄GenBank并獲得登錄號(hào)GU188855。

該基因的cDNA序列全長(zhǎng)1 984個(gè)堿基,含有7個(gè)堿基和 351個(gè)堿基的 5′和3′非編碼區(qū),包括一個(gè)1 626個(gè)堿基的開放讀碼框,編碼541個(gè)氨基酸組成的多肽,分子量61.86 ku,多肽的等電點(diǎn)為4.75。該基因的cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列見圖1。

圖1 苜蓿實(shí)夜蛾幾丁質(zhì)脫乙?；竎DNA序列(GenBank登錄號(hào)GU188855)和推導(dǎo)的氨基酸序列

2.2 苜蓿實(shí)夜蛾幾丁質(zhì)脫乙酰基酶氨基酸序列分析

利用ExPASy網(wǎng)站的蛋白結(jié)構(gòu)域分析軟件Scan-Prosite結(jié)合Radhika Dixit[3]對(duì)幾丁質(zhì)脫乙?；附Y(jié)構(gòu)域的分析,發(fā)現(xiàn)作者克隆的cDNA序列推導(dǎo)的氨基酸序列具有幾丁質(zhì)脫乙酰基酶所具有的3個(gè)明顯結(jié)構(gòu)區(qū):幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)(chitin binding Peritrophin-A domain)(47～103),催化區(qū)(catalytic domain)(199～355),低密度脂蛋白受體區(qū)(low-density lipoprotein receptor class A domain)(LDLa)(124～158)。

SignalP 3.0 Server進(jìn)行信號(hào)肽分析時(shí)發(fā)現(xiàn)在氨基酸的 23和 24位之間存在一個(gè)信號(hào)肽切割位點(diǎn)。

利用NetNGlyc 1.0 Server進(jìn)行N位糖基化位點(diǎn)分析時(shí)發(fā)現(xiàn),在氨基酸序列中存在3個(gè)N位糖基化位點(diǎn),分別為 246 NYSA、276 NATV和298 NITD,證明該蛋白序列屬于一種糖蛋白,在昆蟲體內(nèi)需要經(jīng)過糖基化作用才能有效發(fā)揮酶活性。

2.3 昆蟲幾丁質(zhì)脫乙?；赴被嵝蛄幸恢滦院拖到y(tǒng)進(jìn)化分析

把克隆的苜蓿實(shí)夜蛾幾丁質(zhì)脫乙?；傅陌被嵝蛄杏肗CBI中的Blast軟件進(jìn)行搜索得到多個(gè)高一致性氨基酸序列,同時(shí)搜索已發(fā)表的CDA氨基酸序列3個(gè),一致性結(jié)果如表1所示。氨基酸序列的一致性比較表明:苜蓿實(shí)夜蛾幾丁質(zhì)脫乙?；傅陌被嵝蛄信c棉鈴蟲CDA(GQ411189)一致性達(dá)到98%,與埃及伊蚊CDA(XM_001656773)、赤擬谷盜CDA(NM_001102476)、岡比亞按蚊CDA(XM_320597)、黑腹果蠅CDA(NM_168811)、意大利蜜蜂CDA(XM_391915)的一致性也都達(dá)到84%以上,而與另外3種昆蟲粉紋夜蛾CDA(AY966402)、蓓帶夜蛾CDA(EU660852)和棉鈴蟲CDA(GQ411190GQ411191EF600051)氨基酸序列間的一致性只有36%～38%,一致性較低。系統(tǒng)進(jìn)化分析樹表明(圖3),本文所列舉的12個(gè)CDA屬于兩類不同的CDA類群,它們之間差異較大,特別是在N端150個(gè)氨基酸內(nèi)存在較大差異(圖2)。

表1 不同昆蟲來源CDA基本特征及與苜蓿實(shí)夜蛾CDA序列的一致性

3 討論

2005年首個(gè)能夠編碼類似CDA的cDNA從粉紋夜蛾(Trichop lusia ni)的中腸中被克隆出來[10]。該CDA與中腸圍食膜緊密結(jié)合,雖然沒有幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū),但具有很強(qiáng)的幾丁質(zhì)結(jié)合活性。但該研究沒有證明出這個(gè)CDA具有幾丁質(zhì)脫乙?；傅幕钚?。2006年有2個(gè)能編碼具有典型CDA功能域的CDA從黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)中克隆出來[11-12]。2008年至今從棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)中克隆得到4個(gè)CDA基因,分別屬于2個(gè)不同的 CDA類型,但沒有進(jìn)行活性和功能的研究[13]。2009年在對(duì)赤擬谷盜(Tribolium castaneum)中編碼具有CDA功能區(qū)蛋白的分析表明在該蟲體內(nèi)存在多種CDA,并利用RNA干擾技術(shù)對(duì)各個(gè)CDA的功能進(jìn)行了研究,結(jié)果表明注射TcCDA3到TcCDA9的dsRNAs后,昆蟲沒有可觀測(cè)到的表型變化,而注射 TcCDA1或 TcCDA2的dsRNAs后能影響昆蟲的蛻皮和羽化過程,昆蟲不能夠脫去舊表皮,成蟲期表現(xiàn)出明顯的形態(tài)變化[9]。另外一種夜蛾科昆蟲蓓帶夜蛾(Mamestra conf igurata)的研究結(jié)果表明,該蟲中與粉紋夜蛾一致的CDA基因在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)出了酶活性[14]。

圖2 苜蓿實(shí)夜蛾與其他昆蟲幾丁質(zhì)脫乙?；赴被嵝蛄斜葘?duì)分析

圖3 苜蓿實(shí)夜蛾與其他昆蟲幾丁質(zhì)脫乙?；赴被嵝蛄邢到y(tǒng)進(jìn)化分析

本研究中列舉的CDA氨基酸序列分析表明,苜蓿夜蛾CDA的氨基酸序列與其他昆蟲之間的一致性存在較大差異,CDA的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果可以明顯分為2類,一類氨基酸一致性在80%以上,另一類氨基酸序列一致性不到40%,比對(duì)結(jié)果表明同一昆蟲體內(nèi)可能存在多類CDA。昆蟲CDA在系統(tǒng)進(jìn)化樹上的相互關(guān)系不能完全符合形態(tài)分類關(guān)系也表明在昆蟲體內(nèi)可能存在多種CDA,在棉鈴蟲中已經(jīng)克隆出 4個(gè) CDA基因,分別屬于2個(gè)不同的CDA類群,初步證明了我們的推斷。CDA 2個(gè)類群除了氨基酸序列差異較大以外,在結(jié)構(gòu)域上也存在較大差異,與苜蓿實(shí)夜蛾CDA氨基酸一致性在80%以上的類群均存在典型的3個(gè)功能域,幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)、催化區(qū)、低密度脂蛋白受體區(qū);而與之一致性不足40%的類群只有一個(gè)結(jié)構(gòu)域,沒有幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)和低密度脂蛋白受體區(qū)。本文中只克隆了苜蓿實(shí)夜蛾CDA的cDNA序列一條,為全面了解CDA基因的種類和功能,苜蓿實(shí)夜蛾體內(nèi)其他類型CDA還需進(jìn)一步的試驗(yàn)證實(shí)。

如果CDA具有酶活性,那么在它催化下可使幾丁質(zhì)產(chǎn)生殼聚糖,而殼聚糖對(duì)圍食膜可能具有4種重要功能:殼聚糖的存在可以調(diào)節(jié)幾丁質(zhì)的柔韌性和硬度[11,13];由于殼聚糖具有抗氧化劑的特性使其具有氧化還原調(diào)控作用,因此使圍食膜成為抗氧化物質(zhì)[15-16];殼聚糖具有抗菌功能[17];殼聚糖的存在利于其他蛋白與幾丁質(zhì)的結(jié)合[13]。因此無論研究哪一類CDA,都必須對(duì)其活性進(jìn)行測(cè)定,本研究后續(xù)工作將著重對(duì)克隆的基因進(jìn)行表達(dá)和活性測(cè)定,明確該基因的功能,為進(jìn)一步實(shí)踐應(yīng)用創(chuàng)造條件。

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