艾灸對類風濕關節(jié)炎模型大鼠跖關節(jié)中細胞因子的影響

羅磊 胡玲 宋小鴿 唐照亮 何璐 蔡榮林 郝峰

類風濕性關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是以對稱性多關節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的異質性、系統(tǒng)性、自身免疫性疾病。據報道，中國的RA患病率0.32% ～0.36%左右［1］。歷代中醫(yī)典籍中雖沒有記載類風濕關節(jié)炎這個病名，但依據其疼痛遍歷肢節(jié)等臨床癥狀而言，當屬中醫(yī)學“痹病”、“歷節(jié)”、“痛風”等范疇。局部關節(jié)疼痛為類風濕關節(jié)炎的主要癥狀。本課題組前期研究表明，艾灸能顯著改善類風濕關節(jié)炎模型大鼠局部和全身癥狀，減輕關節(jié)腫脹，提高大鼠進食、進水量，并能有效調節(jié)大鼠血清中白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-2(IL-2)、腫瘤壞死因子(TNF)含量，改善神經免疫調節(jié)機制，糾正炎癥時自由基代謝紊亂，誘導滑膜炎癥細胞凋亡、改善局部關節(jié)滑膜細胞超微結構［2-8］。本研究以RA模型大鼠局部跖關節(jié)中細胞因子為研究對象，進一步揭示艾灸的局部抗炎免疫機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

Wistar大鼠，由南京醫(yī)科大學實驗動物中心提供［合格證號:SCXK(蘇)2008-0004］，清潔級，雄性，月齡3～4月，體重180～220 g，120只。

大鼠適應性喂養(yǎng)一周后，按照《衛(wèi)生統(tǒng)計學》隨機數(shù)字表［9］隨機抽取20只為正常組，放于室溫18～20℃動物房內常規(guī)喂養(yǎng)，正常飲水進食。其余大鼠進行模型復制，模型復制成功后，隨機分為模型組、藥物組、針刺組、艾灸組、CO2激光組，每組20只。模型組不做任何處理，其余各組分別給予相應治療。整個實驗過程均按照實驗動物倫理學的規(guī)定進行。

1.2 主要試劑及儀器

特制香煙型純艾條(Φ=5 mm，南陽市臥龍漢醫(yī)艾絨廠，061205);漢醫(yī)針灸針(天津杏林書院醫(yī)療器械有限公司，040601);雷公藤多甙片(上海復旦復華藥業(yè)有限公司，070402);弗氏完全佐劑(美國SIGMA公司，10 ml，068K8761);IL-1免疫組化試劑盒(北京博奧森，908267W);IL-2免疫組化試劑盒(北京博奧森，906234H);TNF免疫組化試劑盒(北京博奧森，862471K)。

自制鋁合金、玻璃造模箱:1.2 m×1.0 m×0.8 m(1 m×0.6 m×0.5 m);CO2激光治療儀(ML015-CA，上海萬奇光電技術有限公司);高效熒光顯微鏡(Olympus，BX51);數(shù)碼照相裝置(Olympus，DP70)。

1.3 模型復制

采用風、寒、濕環(huán)境因素加生物因子復合造模方法［4］，復制RA模型大鼠。將大鼠放置在可控制溫度、濕度的自制造模箱內，使箱內溫度控制在(6±2)℃，濕度80% ～90%。所有需要造模的大鼠均放入上述造模箱中20天(12小時/天)(20∶00-8∶00)。第21天給大鼠足跖部注射完全弗氏佐劑0.15 ml/只，建立RA大鼠模型。觀察3天，以24小時出現(xiàn)足踝部急性炎癥腫脹，48小時出現(xiàn)繼發(fā)性全身多發(fā)性關節(jié)炎，表現(xiàn)為前肢或對側肢體甚至耳、尾部紅腫或炎性結節(jié)出現(xiàn)，示模型復制成功。

1.4 取穴與治療方法

參照文獻［2-7］，選取“足三里”和“腎俞”穴，根據“大鼠穴位圖譜”，分別作穴區(qū)定位，剪去各穴區(qū)被毛，標記顏色。致炎造模3天后，艾灸組用特制香煙型純艾條距穴2 cm處懸灸;CO2激光組應用10.6 μm CO2激光治療儀進行穴位照射，輸出端距穴2 cm，激光光斑直徑為2 mm;針刺組用1寸毫針(25 mm)于穴區(qū)消毒后快速進針，針刺深度參考《實驗針灸學》。各組治療時，“腎俞”、“足三里”二穴交替使用，每天一穴(雙側)，每天1次，每次20分鐘，連續(xù)治療15天;藥物組進行雷公藤溶液灌胃給藥，濃度為 1.6 mg/ml，劑量按 8 mg/(kg·d)，即每100 g大鼠灌胃0.5 ml，每天1次，共灌藥15天，平均總量為 24 mg/只，計 15 ml［10］。正常組和模型組大鼠不作任何治療處理。

1.5 取材方法

實驗第39天，用1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠仰位固定，取大鼠右足跖關節(jié)。脫鈣固定，待測，檢測方法參照免疫組化試劑盒說明。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 大鼠行為觀察

正常組大鼠皮毛光澤，色白，精神佳，活動自如，反應靈敏，飲食正常。致炎造模后，可觀察到模型組大鼠皮毛黯淡發(fā)黃、糾結無光澤，尾部出現(xiàn)數(shù)量不一、程度不等的結節(jié)，部分大鼠爬行困難，病變累及未注射弗氏完全佐劑(FCA)的足爪，納食減少，大便稀軟，脫毛情況較嚴重。然而，其它各治療組大鼠的毛發(fā)、進食飲水量，活動度等方面均可觀察到不同程度的改善。

2.2 跖關節(jié)中細胞因子IL-1β、IL-2、TNF-α 的測定結果

模型組大鼠跖關節(jié)中IL-1β、TNF-α的平均光密度和灰度與正常組比較顯著性增高(P＜0.01，或P＜0.05)，IL-2的平均光密度和灰度顯著性降低(P＜0.01)，說明模型組大鼠局部跖關節(jié)中細胞免疫紊亂，Th1/Th2失去平衡，炎性反應明顯。經15天治療后，艾灸組、針刺組及CO2激光組均能下調類風濕關節(jié)炎大鼠跖關節(jié)中IL-1β、TNF-α的平均光密度和灰度，上調IL-2的平均光密度和灰度，與模型組比較差異性顯著(P＜0.01或P＜0.05)，與雷公藤多甙藥物組比較無顯著性差異(P＞0.05)，說明艾灸、針刺及CO2激光穴位照射具有降低局部跖關節(jié)中促炎癥細胞因子IL-1β和TNF-α，提高T細胞生長因子IL-2的效應，良性調整Th1/Th2平衡，糾正細胞免疫紊亂，與雷公藤多甙治療效果相當。見表1和圖1～2。

3 討論

艾灸療法起源于中國，源遠流長，是針灸醫(yī)學的重要組成部分，也是中醫(yī)防病治病的一個重要手段。灸法可治寒、熱、虛、實諸證，對百余種病癥有很好的療效，具有廣泛的適應證，其獨特的診療方法、顯著的療效和豐富的文獻資料是人類傳統(tǒng)醫(yī)學的寶貴財富。灸法治療類風濕關節(jié)炎，是中國傳統(tǒng)醫(yī)學的特色之一，在國際上獨樹一幟。《千金方》載:“歷節(jié)風痛，但痛處灸二七壯，佳?！薄侗怡o心書》:“于痛處灸五十壯自愈?！闭n題組前期研究已證實，艾灸對RA大鼠有明顯的鎮(zhèn)痛、抗炎、消腫作用，灸治“腎俞”、“足三里”穴不僅能抑制血清中 TNF、IL-1等炎癥因子的釋放，改善與增強機體的免疫功能，糾正炎癥時自由基代謝的紊亂，而且亦存在誘導滑膜炎癥細胞的凋亡、改善滑膜細胞超微結構等多方面作用［2-8］。

細胞因子是一類由免疫細胞和相關細胞經刺激而分泌的具有高活性、多功能的小分子蛋白質的統(tǒng)稱。在很多情況下，多種免疫細胞間的相互作用是通過細胞因子介導的，細胞因子通過作用于靶細胞的特異受體而表現(xiàn)其活性［11］。根據細胞因子的傳統(tǒng)名稱和生物學特性可以分為:白細胞介素(IL)、干擾素(IFN)、腫瘤壞死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)、生長因子(GF)、趨化性細胞因子等。大量研究發(fā)現(xiàn)艾灸足三里、腎俞、關元穴能明顯升高血清中IL-2的水平，降低血清IL-1、IL-6、TNF、一氧化氮(NO)的水平，從而在一定程度上增強和改善機體的免疫機能，糾正機體免疫紊亂［12，13］。

表1 不同組別大鼠IL-1、IL-2、TNF-α 比較(±s，n=20)

表1 不同組別大鼠IL-1、IL-2、TNF-α 比較(±s，n=20)

注:與模型組比較，aP ＜0.05，bP ＜0.01;與正常組比較，cP ＜0.05，dP ＜0.01;與艾灸組比較，eP＜0.05。

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通過文獻檢索發(fā)現(xiàn)，在探討艾灸治療類風濕關節(jié)炎的作用機制過程中，多數(shù)集中在對模型大鼠血清中細胞因子的觀察，較少見對類風濕關節(jié)炎局部病變影響的報道。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠跖關節(jié)中促炎癥細胞因子IL-1、TNF含量顯著增高，生長因子IL-2水平顯著降低，與正常組比較差異較大;而且各治療組均能不同程度的下調跖關節(jié)中的IL-1、TNF含量，上調IL-2含量。這一結果與大鼠行為學的改善相類似。表明艾灸對局部關節(jié)組織中細胞因子的紊亂具有良性調節(jié)作用。結合前期基礎發(fā)現(xiàn)，艾灸不僅能夠調節(jié)全身血清中細胞因子紊亂，而且對局部關節(jié)組織中的細胞因子亦存在調整作用。這一結果表明，艾灸對局部關節(jié)組織中細胞因子的調節(jié)亦是其抗炎免疫機制之一。然而大多數(shù)研究主要集中在促炎因子如IL-1、TNF等細胞因子的研究上，其他細胞因子也可能參與了艾灸免疫調節(jié)作用，如IL-4、IL-10、IL-13等抑炎因子的參與。因此，從促炎因子和抑炎因子兩個方面，即從Th1/Th2平衡調節(jié)方面，并以全身血液和局部關節(jié)為研究載體觀察艾灸抗炎免疫機制，還有待于進一步研究。

通過研究結果發(fā)現(xiàn)，艾灸組、針刺組與藥物雷公藤多甙組具有相似的效應，均能不同程度的改善局部關節(jié)中細胞因子的紊亂，提示艾灸療法與針刺療法同樣存在抗炎免疫的作用，其對IL-1、IL-2、TNF的影響可能是共同的抗炎免疫機制，至于艾灸與針刺間是否存在特異性抗炎免疫機制，仍待進一步探討。

本實驗所采用的ML015-CA型10.6 μm CO2激光治療儀為模擬艾灸效應的新型激光治療儀。而波長為10.6 μm的CO2激光，能在表皮0.2 mm內被吸收，使皮膚表面溫度明顯提高，其熱效應較為持久［14］，且具有模擬艾灸的效應［15，16］。同時，本實驗結果發(fā)現(xiàn)波長為10.6 μm的CO2激光亦存在下調IL-1、TNF水平，上調IL-2水平的作用，與艾灸抗炎免疫效應相似。因此，艾灸在治療RA過程中所產生的紅外光譜可能是艾灸發(fā)揮抗炎免疫效應的機制之一。但是CO2激光穴位照射的效應是否可與艾灸的效應等同;其他波長的CO2激光或其他激光照射是否具有類似的作用;艾灸治療過程中的溫熱刺激是否存在一定作用;艾葉本身的有效成分——艾油等作用于局部穴位后是否亦存在類似的效應，仍需進一步深入探討，為探明艾灸發(fā)揮治療效應的作用原理及其內在機制提供準確而全面的依據。

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