液相色譜法測(cè)定牛奶中三聚氰胺殘留量的不確定度

金 立，沈林輝，曹向英，孫文梅，朱 駿

（上海市松江區(qū)食用農(nóng)產(chǎn)品安全監(jiān)督檢測(cè)中心，上海 松江 201611）

三聚氰胺俗稱密胺、蛋白精，相對(duì)分子質(zhì)量為126.12，其進(jìn)入體內(nèi)后幾乎不能被代謝，而是從尿液中原樣排出。但是，由于體質(zhì)不同，它會(huì)在身體內(nèi)與氰脲酸結(jié)合生成晶體狀聚合物，從而引起腎結(jié)石、膀胱結(jié)石等癥狀。本文通過數(shù)學(xué)建模，對(duì)GB/T 22388-2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法——高效液相色譜法》測(cè)定牛奶中三聚氰胺殘留量的不確定度來源進(jìn)行分析，并對(duì)測(cè)量的不確定度進(jìn)行評(píng)定。

1 實(shí)驗(yàn)過程

1.1 儀器與設(shè)備 Waters2695高效液相色譜儀（2487紫外檢測(cè)器）；Eppendorf 5810離心機(jī)；AE240分析天平（感量為 0.000 01g），Mettler Toledd公司生產(chǎn)；科導(dǎo)超聲波清洗機(jī)；Waters SCX陽(yáng)離子交換固相萃取柱（60mg/3mL）。

1.2 材料與試劑 樣品為隨機(jī)抽檢的牛奶三聚氰胺高純度試劑（純度>99%），F(xiàn)LUKA；己烷磺酸鈉、甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.3 樣品處理 稱取2g（±0.01g）試樣，置50mL具塞離心管中，加1%三氯乙酸溶液15mL和5mL乙腈，超聲提取10min，4 000 r/min離心10min。上清液用三氯乙酸溶液潤(rùn)濕的濾紙過濾后，再用三氯乙酸溶液定容至25mL，移取5mL濾液，加入5mL水混勻后作待凈化液。

固相萃取柱依次用3mL甲醇和5mL水活化。取所有待凈化液過柱，依次用3mL水和3mL甲醇洗滌，擠干，用6mL氨化甲醇洗脫。洗脫液于50℃下用氮?dú)獯蹈桑昧鲃?dòng)相1.0mL定容，渦旋混合1min，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后作為試樣溶液，供高效液相色譜法測(cè)定。

1.4 數(shù)學(xué)模型

式中：X——供試試樣中三聚氰胺的殘留量（mg/kg）；

A——試樣溶液中相應(yīng)三聚氰胺的峰面積；

As——對(duì)照溶液中相應(yīng)三聚氰胺的峰面積；

Cs——對(duì)照溶液中相應(yīng)三聚氰胺的濃度（μg/kg）；

V——樣液最終定容體積（mL）；

m——供試試樣的質(zhì)量（g）。

2 測(cè)量不確定度的來源

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的不確定度u（Cs）

2.2 試樣的稱樣量不確定度u（m）

2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的不確定度u（std）

2.4 試樣峰面積測(cè)定的不確定度u（A）

2.5 定容體積的不確定度u（V）

2.6 試樣中添加回收率的不確定度u（R）

3 測(cè)量不確定度的計(jì)算

3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的不確定度u（Cs）

3.1.1 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書提供的信息，三聚氰胺的純度≥99.0%，不確定度半寬a=1%，服從均勻分布不確定度為：

3.1.3 配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的不確定度

（2）充滿液體至容量瓶刻度的變動(dòng)性，通過重復(fù)測(cè)定進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，重復(fù)10次統(tǒng)計(jì)出標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.12mL，從而引起的相對(duì)不確定度：

（3）實(shí)驗(yàn)室的溫度波動(dòng)范圍一般為±5℃，20℃玻璃器具膨脹系數(shù)為2.5×10-5/℃，水體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，甲醇體積膨脹系數(shù)為 1.2×10-3/℃。實(shí)驗(yàn)過程中使用的甲醇溶液(1∶1,V/V)的平均體積膨脹系數(shù)為7.0×10-4/℃。容量瓶校準(zhǔn)溫度與使用溫度不同引起的體積不確定值：

按照均勻分布換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

3.1.4 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程產(chǎn)生的不確定度 評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)工作液是由三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋得到的，質(zhì)量濃度分別為 0.8、2、20、40 μg/mL。標(biāo)準(zhǔn)工作液制備過程使用了一系列玻璃量具，根據(jù)JJG 196-2006要求，均有相應(yīng)最大允差，按均勻分布，相對(duì)不確定度分量見表1。

求出此分量的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

表1 標(biāo)準(zhǔn)液配制過程中量具校準(zhǔn)引起的不確定度

3.2 試樣的稱樣量u（m）

（1）天平稱量變動(dòng)性：標(biāo)準(zhǔn)偏差0.02mg。

相對(duì)不確定度：ur（elm）=u（m）/m＝0.035（/2.0×1000）＝0.0000175

3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合的不確定度u（std） 用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度-峰面積曲線。分別測(cè)定4 種質(zhì)量濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液 0.8、2、20、40μg/mL，每種質(zhì)量濃度分別測(cè)3次，得到相應(yīng)的峰面積A，測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度-峰面積結(jié)果

用表2數(shù)據(jù)以最小二乘法擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=87276X-9127，R2=0.9998。

峰面積測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差S為：

校準(zhǔn)曲線擬合的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（std）為：

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合的相對(duì)不確定度：

對(duì)被測(cè)樣品處理溶液測(cè)量?jī)纱?，即p=2；n表示標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定次數(shù)，n=12；a表示截距，a=-9 127；b為斜率，b=87 276；C0為處理液中三聚氰胺最佳估計(jì)值（2.00mg/kg）；Ci表示標(biāo)準(zhǔn)溶液各點(diǎn)的三聚氰胺含量；表示標(biāo)準(zhǔn)溶液中三聚氰胺含量的平均測(cè)定值（15.7mg/L）。

3.4 樣品峰面積測(cè)定的不確定度u（A） 由于測(cè)量次數(shù)較少，根據(jù)JJF 1059-1999《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》中，采用極差法進(jìn)行評(píng)定，其中n=6，C=3.0。標(biāo)準(zhǔn)不確定度：uA=（222706-217451）/3=1751。

表3 重復(fù)進(jìn)樣測(cè)量結(jié)果

3.5 定容體積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（V）

3.5.1 定容采用1mL單刻度吸量管A級(jí)，按檢定規(guī)程JJG 196-2006要求,最大允差為0.007mL，按照均勻分布考慮，則定容體積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.5.2 1mL單標(biāo)線吸量管校準(zhǔn)溫度與使用溫度不同引起的體積不確定度：

按照均勻分布換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差：

由以上兩項(xiàng)合成得出：

3.6 試樣中添加回收率的不確定度u（R） 因樣品前處理不完全或處理過程中三聚氰胺的損失，通過添加三聚氰胺（質(zhì)量濃度7.5mg/kg）計(jì)算加標(biāo)回收率：

表4 回收率測(cè)定結(jié)果（添加濃度為7.5mg/kg，n=6）

3.7 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的計(jì)算

3.8 擴(kuò)展不確定度 擴(kuò)展不確定度可由合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子，取置信水平為95%，則k=2，試樣中三聚氰胺含量測(cè)定的相對(duì)擴(kuò)展不確定度u=urel（X）×k=0.080。試樣中三聚氰胺含量的最佳估計(jì)值（X）=2.00mg/kg，故其擴(kuò)展不確定度 u=2.00mg/kg×0.080=0.160mg/kg。

4 不確度報(bào)告

用高效液相色譜法測(cè)定奶粉中的三聚氰胺含量，當(dāng)取樣量為2.00g，k=2（95%置信度）時(shí)，測(cè)得牛奶中三聚氰胺的含量為（2.00±0.160）mg/kg。

[1]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T 22388-2008原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[2]田玉平，王 虎，蔣和平.高效液相色譜法測(cè)定乳及乳制品中三聚氰胺含量的不確定評(píng)定[J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2010，29（1）：41-43.

[3]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.JJF 1135-2005化學(xué)分析測(cè)量不確定度評(píng)定[S].北京：中國(guó)計(jì)量出版社，2005：1-12.

[4]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.JJG 196-2006常用玻璃量器檢定規(guī)程[S].北京：中國(guó)計(jì)量出版社，2006：6-9.

[5]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.JJF 1059-1999測(cè)量不確定度評(píng)定與表示[S].北京：中國(guó)計(jì)量出版社，1999：1-31.