陳 麗，郭美錦，儲 炬，莊英萍，張嗣良

(華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室 國家生化工程技術(shù)研究中心，上海 200237)

胰島素是體內(nèi)調(diào)節(jié)能量代謝和糖代謝的重要激素，是治療糖尿病的特效藥物之一，重組胰島素已占領(lǐng)了大部分市場份額[1]。甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母(Pichiapastoris)是一種優(yōu)秀的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，具有乙醇氧化酶基因啟動子(PAOX)強、外源蛋白表達(dá)量高、分離容易、外源基因穩(wěn)定性高、培養(yǎng)基要求低等特點[2]，其高密度發(fā)酵工藝日臻成熟。目前，大約有500多種外源蛋白成功地在該系統(tǒng)中得到表達(dá)[3]。鑒于酵母直接表達(dá)人胰島素原比較困難，作者采用表達(dá)豬胰島素前體(Porcine insulin precursor，PIP)，再通過純化和體外轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，以轉(zhuǎn)化為醫(yī)用人胰島素[4]。

基因劑量(Gene dosage)是重組畢赤酵母表達(dá)外源目的蛋白水平高低的重要影響因素之一。根據(jù)不同的外源蛋白特性，基因劑量對外源蛋白表達(dá)水平既有正的量效關(guān)系，也有負(fù)的量效關(guān)系，且各自影響機理不盡相同[5]。目前用畢赤酵母表達(dá)PIP的報道較多停留在菌株的構(gòu)建和過程控制優(yōu)化等方面[6，7]，而基因劑量方面的研究至今缺乏系統(tǒng)性報道。為此，作者以PIP基因拷貝數(shù)分別為1、6、12和18的G1、G6、A2和A3畢赤酵母重組菌為研究對象，通過5 L發(fā)酵罐進(jìn)行補料分批培養(yǎng)，考察PIP基因拷貝數(shù)對畢赤酵母重組菌PIP蛋白表達(dá)、生理代謝參數(shù)、細(xì)胞存活率和基因穩(wěn)定性等的影響。

1 實驗

1.1 菌株、培養(yǎng)基和種子制備

畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115菌株，Mut+，載體pAO815、pPIC3.5K，蛋白引導(dǎo)序列來自釀酒酵母的α-雜交因子(α-Mating factor，α-MF)，外源基因為根據(jù)畢赤酵母偏愛密碼子人工合成的PIP基因，將含目的基因1、6、12和18拷貝的菌株，分別命名為G1、G6、A2和A3，自行構(gòu)建[8]。

培養(yǎng)基和種子制備按文獻(xiàn)[9]方法進(jìn)行。

1.2 5 L發(fā)酵罐發(fā)酵方法

從YPD平板上挑單克隆接種至種子搖瓶培養(yǎng)基中，于30℃、220 r·min-1培養(yǎng)20～24 h，直至OD600達(dá)到20左右；按接種量10%接種到裝有2 L分批培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐(華東理工大學(xué)國家生化工程技術(shù)研究中心研制)中培養(yǎng)(用氨水調(diào)節(jié)pH值為5.0)；分批培養(yǎng)至甘油耗盡(20 h左右)，此時溶氧值與pH值上升，開始以限制性的速度補加含12 mL·L-1PTM1的50%(質(zhì)量濃度，下同)甘油以提高菌濃，當(dāng)OD600達(dá)到120左右，停止補加甘油，饑餓工程菌30 min左右，一次性加入2.5 g·L-1甲醇以使菌體適應(yīng)甲醇環(huán)境，大約2 h左右溶氧值先下降后上升，正式進(jìn)入誘導(dǎo)階段，開始流加含12 mL·L-1PTM1的100%甲醇，誘導(dǎo)72 h。在誘導(dǎo)過程中通過測定甲醇濃度和溶氧值變化來控制補料速率。

1.3 外源基因拷貝數(shù)的測定

酵母總DNA制備采用Bustn′Grab法[10]，外源基因定量參照文獻(xiàn)[11]。

1.4 目的蛋白PIP濃度的測定

采用外標(biāo)法進(jìn)行PIP的定量分析。使用Agilent 1100 HPLC系統(tǒng)，色譜柱為ES industries 公司MacroSep C8，5 μm 300 ?(15 cm×4.60 mm)；流動相：溶液A為20%乙腈-0.1%三氟乙酸；溶液B為90%乙腈-0.1%三氟乙酸；洗脫條件：溶液A 在14 min 內(nèi)由100%降至70%，溶液B在14 min 內(nèi)由0%升至30%；流速為1 mL·min-1；柱溫為40℃；檢測波長為214 nm。

1.5 甲醇濃度的測定

采用GC920型氣相色譜儀(上海海欣色譜儀器有限公司)分析發(fā)酵液上清中甲醇濃度。填料為Chromosorb 101型，色譜柱長1 m、內(nèi)徑2 mm，載氣為氮氣，流量為15 mL·min-1，空氣和H2的流量分別為300 mL·min-1和30 mL·min-1(10∶1)，色譜柱溫度為100℃，汽化室和氫火焰溫度為200℃。

1.6 細(xì)胞活性分析

采用流式細(xì)胞儀[12，13]進(jìn)行細(xì)胞活性分析。

1.7 尾氣分析

采用Extrel過程質(zhì)譜MAX300-LG(USA)對發(fā)酵過程中的進(jìn)氣和尾氣進(jìn)行實時在線采集分析，發(fā)酵液單位體積氧代謝速率(Oxygen uptake rate，OUR，mmol·L-1·h-1)和單位體積CO2釋放速率(CO2Evolution rate，CER，mmol·L-1·h-1)參照文獻(xiàn)[14]計算。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同拷貝數(shù)畢赤酵母重組菌生長比較(圖1)

圖1 不同拷貝數(shù)畢赤酵母流加培養(yǎng)的細(xì)胞光密度變化曲線

由圖1可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，不同拷貝數(shù)菌株的細(xì)胞光密度(OD600)呈不同的變化特征，大致可分為三個階段：在甘油階段(0～28 h)，不同拷貝數(shù)菌株細(xì)胞生長無明顯差別，且生長均較快，OD600可同時達(dá)到140左右；在甲醇誘導(dǎo)初期(誘導(dǎo)0～24 h)，不同拷貝數(shù)菌株細(xì)胞生長雖然比其在甘油階段生長緩慢，但相互之間也沒有明顯的差異，在誘導(dǎo)24 h后OD600均可達(dá)到190左右，這主要是因為不同拷貝數(shù)的菌株誘導(dǎo)初期都需要經(jīng)過一段時間的甲醇誘導(dǎo)PAOX1啟動和醇氧化酶(AOX1)的表達(dá)，從而使細(xì)胞利用甲醇生長[15]；在甲醇誘導(dǎo)24～72 h時，低拷貝數(shù)外源基因重組菌(1拷貝和6拷貝)的生長趨勢基本相似，最大OD600能達(dá)到360，但是高拷貝數(shù)外源基因重組菌(12拷貝和18拷貝)生長緩慢，最大OD600僅為270，明顯低于低拷貝數(shù)菌株。由此可見，拷貝數(shù)對甘油階段和甲醇誘導(dǎo)初期菌株生長無明顯影響，但甲醇誘導(dǎo)24 h后高拷貝數(shù)菌株(12拷貝和18拷貝)生長受到抑制，菌濃明顯低于低拷貝數(shù)菌株(1拷貝和6拷貝)，存在高拷貝數(shù)菌株在甲醇誘導(dǎo)后期生長緩慢現(xiàn)象。

2.2 不同拷貝數(shù)畢赤酵母重組菌PIP蛋白表達(dá)比較(圖2)

圖2 不同拷貝數(shù)畢赤酵母細(xì)胞PIP表達(dá)變化曲線

由圖2可見，經(jīng)過72 h甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)，12拷貝畢赤酵母重組菌株P(guān)IP蛋白表達(dá)水平明顯高于其它拷貝數(shù)菌株的表達(dá)水平，各拷貝數(shù)菌株P(guān)IP最大表達(dá)量呈現(xiàn)“鐘罩型”變化趨勢：從1拷貝的110.105 mg·L-1增加到6拷貝的631.263 mg·L-1再增加到12拷貝的702.000 mg·L-1，隨后18拷貝菌株表達(dá)水平下降到514.526 mg·L-1。因此，12拷貝畢赤酵母菌株P(guān)IP蛋白表達(dá)量分別是1拷貝、6拷貝和18拷貝畢赤酵母菌株的6.376倍、1.112倍和1.360倍。

單位細(xì)胞光密度的PIP表達(dá)量(PIP/OD600)見圖3。

圖3 不同拷貝數(shù)畢赤酵母細(xì)胞PIP/OD600變化曲線

由圖3可知，PIP/OD600與PIP蛋白表達(dá)具有相同的趨勢，即隨著拷貝數(shù)的增加，PIP/OD600先增加后減小，12拷貝菌株的PIP/OD600最大，但不同的是18拷貝菌株的PIP/OD600要大于6拷貝菌株的PIP/OD600。這可能是由于兩者的細(xì)胞生物量不同引起的。

2.3 不同拷貝數(shù)重組畢赤酵母單位體積氧代謝速率與單位體積CO2釋放速率比較(圖4)

圖4 不同拷貝數(shù)畢赤酵母細(xì)胞OUR、CER和RQ的變化曲線

由圖4可知，不同拷貝數(shù)的畢赤酵母細(xì)胞接種經(jīng)過短暫的延遲期后進(jìn)入對數(shù)生長期。(1)在批培養(yǎng)階段，發(fā)酵過程在線參數(shù)單位體積氧代謝速率(OUR)和單位體積CO2釋放速率(CER)呈指數(shù)同步增長；而由于初始細(xì)胞光密度基數(shù)低，其代謝以細(xì)胞維持為主，隨著細(xì)胞光密度的增加，維持能增大，不同拷貝數(shù)畢赤酵母細(xì)胞呼吸商(Respiratory quotient，RQ=CER/OUR)的值均達(dá)到最大值0.75左右，直到22 h，OUR和CER陡降，表明甘油已經(jīng)耗盡；(2)在甘油補料階段(22～28 h)，不同拷貝數(shù)畢赤酵母細(xì)胞的OUR、CER同時開始上升，RQ值雖然比批培養(yǎng)階段低，但是在此階段卻基本保持不變，均維持在0.64左右。由于RQ是表征細(xì)胞代謝的生理狀態(tài)參數(shù)，RQ值恒定說明在補甘油階段采用限制性流加策略，能較好地維持細(xì)胞的生理狀態(tài)、控制菌體的生長狀態(tài)，可提高底物甘油的細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，從而有利于減少副產(chǎn)物的形成。發(fā)酵28 h后細(xì)胞達(dá)到一定密度(OD600約為150)，停止補加甘油，此時OUR、CER均急劇下降，說明甘油已不足或代謝完全。(3)在甲醇誘導(dǎo)階段，OUR和CER又同時開始上升，但是出現(xiàn)了增長的“分叉”現(xiàn)象，即上升幅度的非同步性，OUR的上升幅度較CER更大，具體體現(xiàn)在此時RQ出現(xiàn)了明顯的下降趨勢，但是整個蛋白表達(dá)階段RQ一直維持在0.54左右的水平，比細(xì)胞甘油生長階段的RQ明顯要小，這是因為畢赤酵母代謝甲醇有5條途徑，比甘油代謝增加了甲醇完全氧化(RQMax=0.68)和二羥丙酮合成(RQMax=0.67)2條途徑。

不同拷貝數(shù)重組畢赤酵母菌株的OUR和CER具有相同的變化趨勢，但是不同拷貝數(shù)重組菌的OUR和CER等生理代謝仍有差異，在此僅以不同拷貝數(shù)重組菌的OUR為例進(jìn)行比較，見圖5。

圖5 不同拷貝數(shù)畢赤酵母重組菌在補料分批培養(yǎng)中OUR的變化曲線

由圖5可知，不同拷貝數(shù)畢赤酵母菌株批培養(yǎng)階段的OUR均不斷增加，1拷貝和6拷貝菌株約達(dá)到100.00 mmol·L-1·h-1左右，12拷貝和18拷貝菌株OUR稍低些，僅為88.65 mmol·L-1·h-1和73.99 mmol·L-1·h-1。22 h 時不同拷貝數(shù)菌株OUR均下降表明初始甘油已經(jīng)耗盡，這時以限制性速度補加甘油以繼續(xù)增加菌體濃度，在此階段，不同拷貝數(shù)菌株的OUR又開始上升。不同拷貝數(shù)畢赤酵母菌株誘導(dǎo)之前OUR再次處于一個低峰；補加甲醇適應(yīng)2 h后，OUR持續(xù)上升，約在60 h達(dá)到峰值，1拷貝菌株最大達(dá)到185.74 mmol·L-1·h-1，分別是6拷貝、12拷貝和18拷貝菌株的1.32倍、1.45倍和1.55倍，并且不同拷貝數(shù)菌株誘導(dǎo)后最大OUR都比其甘油階段高，這可能是由于細(xì)胞適應(yīng)甲醇后，菌濃增加，需要更多的氧來維持細(xì)胞代謝和蛋白生產(chǎn)，而高拷貝數(shù)菌株比低拷貝數(shù)菌株OUR低的主要原因可能是高拷貝數(shù)菌株細(xì)胞生長較慢。

2.4 不同拷貝數(shù)重組畢赤酵母細(xì)胞存活率比較

在整個發(fā)酵過程中以發(fā)酵初始細(xì)胞的存活率為100%，每24 h取樣1次，共取樣4次，不同拷貝數(shù)細(xì)胞存活率變化曲線見圖6。

圖6 不同拷貝數(shù)畢赤酵母菌細(xì)胞存活率變化曲線

由圖6可知，在細(xì)胞生長階段和誘導(dǎo)初期，不同拷貝數(shù)菌株存活率差異不顯著，均維持在90%以上，這可能是由于在初始階段細(xì)胞光密度不高，產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物少；但在誘導(dǎo)48 h以后不同拷貝數(shù)菌株之間的存活率出現(xiàn)了較大差異，除了1拷貝菌株細(xì)胞存活率在90%外，其它拷貝數(shù)菌株的存活率均急劇下降，18拷貝菌株細(xì)胞存活率下降到78%，而且拷貝數(shù)越高存活率下降越明顯。由此表明，基因拷貝數(shù)的增加容易引起細(xì)胞存活率的下降。

2.5 不同拷貝數(shù)畢赤酵母重組菌外源基因穩(wěn)定性比較

發(fā)酵過程中分別在48 h和96 h取樣2次，提取酵母的總DNA，稀釋500倍后分別對GAP基因和PIP基因做定量PCR反應(yīng)，測定其Ct值。均進(jìn)行2次平行實驗。由建立的GAP基因和PIP基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖7)算出PIP與GAP的拷貝數(shù)，二者的比值即為該樣品的拷貝數(shù)。

圖7 PIP和GAP基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖8可知，在 5 L發(fā)酵罐發(fā)酵48 h 后，不管是低拷貝數(shù)還是高拷貝數(shù)菌株的遺傳穩(wěn)定性均沒有發(fā)生顯著變化；發(fā)酵96 h后，1拷貝菌株P(guān)IP基因拷貝數(shù)穩(wěn)定，6拷貝菌株拷貝數(shù)僅發(fā)生微小變化，但12拷貝和18拷貝菌株P(guān)IP基因的丟失率增加，分別丟失了16.1%和19.4%。這說明在甘油階段和甲醇誘導(dǎo)初期并不影響基因的穩(wěn)定性，但隨著誘導(dǎo)時間的延長，拷貝數(shù)越高基因的不穩(wěn)定性就越大。

圖8 不同拷貝數(shù)畢赤酵母菌的基因穩(wěn)定性

3 結(jié)論

在5 L發(fā)酵罐補料分批發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，在甘油階段和甲醇誘導(dǎo)初期，拷貝數(shù)對畢赤酵母的生長無顯著影響；在甲醇誘導(dǎo)24 h后低拷貝數(shù)菌株(1拷貝和6拷貝)生長不受影響，但高拷貝數(shù)菌株(12拷貝和18拷貝)存在生長緩慢、細(xì)胞存活率急劇下降的現(xiàn)象；隨著拷貝數(shù)的增加，蛋白表達(dá)存在先增加后減小的趨勢，12拷貝時達(dá)到最大值702 mg·L-1；在甘油階段和甲醇誘導(dǎo)初期不同拷貝數(shù)畢赤酵母菌外源基因均表現(xiàn)出很高的穩(wěn)定性，在誘導(dǎo)后期低拷貝數(shù)外源基因穩(wěn)定性所受影響不大，但高拷貝數(shù)菌株外源基因丟失明顯。因此，在利用高拷貝數(shù)的重組畢赤酵母菌株進(jìn)行生產(chǎn)時，應(yīng)多方考慮尋找到最優(yōu)表達(dá)的拷貝菌株。

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