仇 煒，趙 娟，呂雨虹，趙俊霞，王彥玲，雷宇華

(1.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部，北京 100191;2.河北醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室，河北石家莊 050017)

肺癌是我國常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，其中尤以小細(xì)胞肺癌的惡性程度最高，嚴(yán)重影響人類的生命健康。山奈酚(kaempferol)屬黃酮醇類化合物，主要來源于姜科植物山奈(Kaempferia galanga L)的根莖，具有抗腫瘤、抗氧化及組織保護(hù)［1-2］等多種生物活性及藥理作用。目前已知，山奈酚對于非小細(xì)胞肺癌［3］、卵巢癌［4-5］、前列腺癌［6］、乳腺癌［7］等多種腫瘤均有抑制作用，而山奈酚對人小細(xì)胞肺癌是否存在同樣的抑制作用目前尚未見報道，因此本實(shí)驗(yàn)通過觀察山奈酚對人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞株增殖及凋亡的影響，探討其作用機(jī)制，旨在為小細(xì)胞肺癌的藥物治療及拓展山奈酚的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及設(shè)備 試劑山奈酚購自Sigma公司(批號:54608195，純度 ＞96%)，用 DMSO溶解配制成80 mmol·L-1的儲存液，分裝，避光保存于-20℃?zhèn)溆?人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞購自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心;新生牛血清(newborn calf serum，NCS)購自杭州四季青生物工程材料有限公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國 Gibco公司，流式細(xì)胞儀 FACSTARCalibur(美國Becton Dickinson公司)、倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)、DAPI(美國Invitrogen公司)。p53抗體、bax抗體及bcl-2抗體均購自Santa Cruz公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 H446細(xì)胞用含有NCS(體積分?jǐn)?shù)為0.1)的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2、飽和濕度環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，傳代后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用山奈酚進(jìn)行處理，對照組細(xì)胞用終濃度為0.001(體積分?jǐn)?shù))的DMSO處理。各組細(xì)胞在處理前換用新鮮的含NCS(體積分?jǐn)?shù)為0.01)的RPMI 1640培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h。

1.3 MTT法 取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100 μl(約1×104個細(xì)胞)，于37℃，5%CO2、飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后分別加入終濃度為 10、20、40、80 μmol·L-1山奈酚，對照組加入DMSO孵育。分別孵育24、48及72 h后，每孔換用新的培養(yǎng)基并加MTT溶液(5 g·L-1)20 μl，繼續(xù)孵育 4 h，離心 10 min，棄去上清，每孔加DMSO 150 μl，震蕩混勻后用酶標(biāo)儀測570 nm處的A值。以上各組均設(shè)8個復(fù)孔。根據(jù)下列公式計(jì)算抑制率:抑制率/%=［(對照組A﹣實(shí)驗(yàn)組A)/對照組A］×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)分析 各組細(xì)胞徹底消化，收集細(xì)胞后于4℃下500×g離心5 min，用預(yù)冷的PBS溶液反復(fù)洗滌3次后，置于體積分?jǐn)?shù)為0.7的預(yù)冷乙醇溶液中4℃下固定過夜。檢測前，于4℃下500×g離心10 min，PBS漂洗2次。將細(xì)胞重懸于1 ml碘化丙啶(PI)染液中，于4℃搖床避光染色30 min，篩網(wǎng)過濾后應(yīng)用流式細(xì)胞儀(flow cytometer，F(xiàn)CM)對細(xì)胞DNA進(jìn)行定量分析，檢測細(xì)胞周期時相分布及凋亡狀態(tài)。

1.5 DAPI核染色法 用終濃度為20 μmol·L-1的山奈酚處理H446細(xì)胞24 h后吸取培養(yǎng)上清，加入多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗細(xì)胞3次，加入DAPI(300 nmol·L-1)染液室溫染色5 min。PBS洗細(xì)胞3次，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并照相。

1.6 細(xì)胞總蛋白提取和Western blot分析 將各組細(xì)胞收集后，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，加蛋白裂解液將細(xì)胞充分裂解。4℃ 8 000 r·min-1離心10 min，收集上清，使用Bradford法蛋白定量。各組均取等量蛋白，經(jīng)變性處理后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，之后經(jīng)恒流(300 mA)電轉(zhuǎn)膜(50 min)，50 g·L-1脫脂奶粉封閉，于1∶1 000的一抗4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h。TBS洗膜3次后加入ECL發(fā)光液發(fā)光拍照。以β-actin為內(nèi)參，用BIO-RAD圖像分析軟件對條帶灰度值進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 山奈酚抑制人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞增殖

MTT結(jié)果顯示，山奈酚作用H446細(xì)胞24 h后，當(dāng)山奈酚濃度≥10 μmol·L-1時細(xì)胞增殖活力即被明顯抑制(P＜0.05)。用不同濃度的山奈酚(10、20、40、80 μmol·L-1)分別處理 H446 細(xì)胞 24、48 及 72 h，該藥對H446細(xì)胞的抑制率分別為9.8%、25.1%、32.0%、46.2%;16.6%、33.6%、46.6%、68.0%;31.7%、49.0%、58.5%、73.0%;其 IC50值分別為86.6、41.3、24.1 μmol·L-1。以上結(jié)果表明，在不同時間點(diǎn)，隨山奈酚劑量的增加，H446細(xì)胞的增殖活力呈明顯降低趨勢(P＜0.05)(Fig 1)。

2.2 山奈酚誘導(dǎo)H446細(xì)胞阻滯于S期及G2/M期 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測藥物作用后H446細(xì)胞的細(xì)胞周期變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度的山奈酚(10、20、40、80 μmol·L-1)處理 H446 細(xì)胞 24 h 后，G2/M期細(xì)胞所占比例較對照組明顯上升，而G0/G1期細(xì)胞所占比例明顯降低。當(dāng)山奈酚終濃度為10 μmol·L-1時，S期及G2/M期細(xì)胞所占比例較對照組明顯增高(P＜0.01)(Fig 2)。以上結(jié)果證實(shí)，山奈酚可誘導(dǎo)H446細(xì)胞阻滯于S期和G2/M期，山奈酚對H446細(xì)胞的增殖抑制作用可能與其細(xì)胞周期阻滯作用有關(guān)。

Fig 1 Effects of kaempferol on H446 cells proliferation(±s，n=8)

Fig 2 Effects of kaempferol on cell cycle in H446 cells(±s，n=3).

2.3 山奈酚誘導(dǎo)H446細(xì)胞凋亡，上調(diào)p53及bax的表達(dá)水平，下調(diào)bcl-2的表達(dá)水平 細(xì)胞經(jīng)DAPI染色后，倒置熒光顯微鏡觀察可見對照組細(xì)胞胞核界限清晰，呈圓形或橢圓形，染色質(zhì)分布均勻。而山奈酚處理組(20 μmol·L-1)部分細(xì)胞胞核縮小，染色質(zhì)凝集固縮，分布不均(Fig 3)。

Fig 4Effects of kaempferol on apoptosis in H446 cells(±s，n=3)

應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同藥物濃度處理細(xì)胞24 h后，均出現(xiàn)亞二倍體凋亡峰。各組細(xì)胞凋亡率較對照組均有明顯升高(P＜0.01)，且隨著山奈酚濃度(10、20、40、80 μmol·L-1)的增加，細(xì)胞凋亡率呈上升趨勢(4.11%、5.38%、8.34%、17.34%)。(Fig 4)。

Western blot結(jié)果提示，山奈酚處理H446細(xì)胞24 h后，隨藥物濃度的增加，腫瘤抑制因子p53和凋亡促進(jìn)蛋白bax的表達(dá)水平呈升高趨勢，而抗凋亡蛋白bcl-2表達(dá)水平則呈下降趨勢(Fig 5)。因此提示山奈酚誘導(dǎo)的H446細(xì)胞凋亡可能與上調(diào)p53及bax表達(dá)、抑制bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān)。

3 討論

近年來，全世界肺癌發(fā)病率急劇上升，我國的情況亦不容樂觀。肺癌惡性程度較高且起病隱匿，很多患者就診時已處于晚期，喪失了治療的最佳時機(jī)。小細(xì)胞肺癌是惡性程度最高的肺癌，早期即易發(fā)生血行及淋巴轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差，每年由于小細(xì)胞肺癌導(dǎo)致的死亡病例占到了全部肺癌的25%左右［8］，嚴(yán)重危害人類的健康。

Fig 5 Effects of kaempferol on expression of p53，bax and bcl-2 in H446 cells

腫瘤細(xì)胞凋亡失控是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要因素之一?？鼓[瘤藥物主要通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及抑制腫瘤內(nèi)血管形成等方面發(fā)揮其抗腫瘤作用。本研究發(fā)現(xiàn)，山奈酚可明顯抑制人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞增殖，促使H446細(xì)胞阻滯于S期及G2/M期，誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡。p53是重要的腫瘤抑制因子，可通過調(diào)節(jié)bcl-2家族蛋白功能介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［9］。凋亡促進(jìn)蛋白bax及抗凋亡蛋白bcl-2是bcl-2家族中的代表分子，在細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程中也發(fā)揮著重要的作用［10］。本研究證實(shí)，山奈酚可通過上調(diào)H446細(xì)胞中p53及bax的表達(dá)、下調(diào)bcl-2的表達(dá)誘導(dǎo)H446細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果提示，山奈酚聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞周期特異性化療藥治療小細(xì)胞肺癌可能會獲得更好的效果。

山奈酚是植物界中廣泛存在的一種黃酮醇類化合物。山奈酚在48 h對前列腺癌PC-3細(xì)胞和非小細(xì)胞癌肺癌A549細(xì)胞的IC50值分別為52.1 μmol·L-1［6］和 35 μmol·L-1［3］。本實(shí)驗(yàn)中，山奈酚對小細(xì)胞肺癌 H446細(xì)胞48 h的 IC50值為41.3 μmol·L-1，略高于A549細(xì)胞而低于PC-3細(xì)胞，提示山奈酚對于小細(xì)胞肺癌的敏感性略低于非小細(xì)胞肺癌，考慮為細(xì)胞來源不同所致。已有研究發(fā)現(xiàn)，山奈酚可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯于S及G2/M期，從而抑制人前列腺癌PC-3細(xì)胞［6］及人乳腺癌細(xì)胞MDAMB-453［7］增殖。另外，山奈酚還可通過上調(diào)bax及bad的表達(dá)，下調(diào)bcl-XL的表達(dá)誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞［5］及非小細(xì)胞癌肺癌細(xì)胞凋亡［3］，推測山奈酚可能有廣譜的抗腫瘤效應(yīng)。因此，長期進(jìn)食含有山奈酚的食物，對于小細(xì)胞肺癌及其他惡性腫瘤的預(yù)防亦有重要意義。

［1］ Kim J K，Choi S J，Cho H Y，et al.Protective effects of kaempferol(3，4'，5，7-tetrahydroxyflavone)against amyloid beta peptide(Abeta)-induced neurotoxicity in ICR mice［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2010，74(2):397-401.

［2］ 張 錦，趙翠翠，韓維娜，等.黃酮類化合物對心肌細(xì)胞凋亡的作用［J］. 中國藥理學(xué)通報，2008，24(5):635-9.

［2］ Zhang J，Zhao C C，Han W N，et al.Effects of flavonoids on myocardial apoptosis［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(5):635-9.

［3］ Nguyen T T，Tran E，ong C K，et al.Kaempferol-induced growth inhibition and apoptosis in A549 lung cancer cells is mediated by activation of MEK-MAPK［J］.J Cell Physiol，2003，197(1):110-21.

［4］ Luo H，Rankin G O，Liu L，et al.Kaempferol inhibits angiogenesis and VEGF expression through both HIF dependent and independent pathways in human ovarian cancer cells［J］.Nutr Cancer，2009，61(4):554-63.

［5］ Luo H，Rankin G O，Li Z，et al.Kaempferol induces apoptosis in ovarian cancer cells through activating p53 in the intrinsic pathway［J］.Food Chem，2011，128(2):513-9.

［6］ 仇 煒，雷宇華，蘇 明，等.下調(diào)PCNA和VCAM-1表達(dá)參與山柰酚抑制人前列腺癌細(xì)胞增殖［J］.中國藥理學(xué)通報，2011，27(4):553-7.

［6］ Qiu W，Lei Y H，Su M，et al.Kaempferol inhibits proliferation of human prostate cancer PC-3 cells via down-regulation of PCNA and VCAM-1［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(4):553-7.

［7］ Choi E J，Ahn W S.Kaempferol induced the apoptosis via cell cycle arrest in human breast cancer MDA-MB-453 cells［J］.Nutr Res Pract，2008，2(4):322-5.

［8］ Taimur S，Grace D Y，Alex A，et al.Small cell lung cancer［J］.Mayo Clin Proc，2008，83(3):355-67.

［9］ Angelina V V，Ute M M.The mitochondrial p53 pathway［J］.Biochim Biophys Acta，2009，1787(5):414-26.

［10］ Korsmeyer S J，Shutter J R，Veis D J，et al.Bcl-2/Bax:a rheostat that regulates an anti-oxidant pathway and cell death［J］.Semin Cancer Biol，1993，4(6):327-32