肖萍萍，陳君敏，葉德富

二膦酸鹽是治療骨髓瘤骨病(MBD)的主要藥物，已有的證據(jù)認(rèn)為二膦酸鹽抑制破骨細(xì)胞(OC)前體增殖，抑制OC形成并誘導(dǎo)凋亡。但近年來研究發(fā)現(xiàn)二膦酸鹽還能促進(jìn)成骨細(xì)胞(OB)的增殖分化。二膦酸鹽治療MBD的作用是否通過改變細(xì)胞核因子κ-B受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor κ-B ligand，RANKL)和護(hù)骨素(osteoprotegerin，OPG)表達(dá)水平，目前看法不一。為進(jìn)一步了解二膦酸鹽治療MBD的機(jī)制，我們在多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)患者從骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)誘導(dǎo)分化的 OB加入唑來膦酸(zoledronic acid，第3代二膦酸鹽)，考察其對OB增殖及OB表達(dá)RANKL和OPG的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 低糖DMEM培養(yǎng)基干粉和0.0025胰蛋白酶均購自Gibco公司，人淋巴細(xì)胞分離液(天津市灝洋生物制品有限責(zé)任公司)，新生胎牛血清(Hyclone公司)，青、鏈霉素(Hyclone公司)，地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C均購自美國 Sigma公司，BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，Cell Counting kit(CCK-8，同仁化學(xué)研究所)，唑來膦酸(北京諾華制藥有限公司)，引物合成(上海生工)，TRIzol液(Tri Reagent公司)，cDNA第一鏈合成試劑盒(RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit#K1622，F(xiàn)ermentas公司)，PCR Master Mix(廈門泰京生物工程有限公司)，sRANKL ELISA Kit(美國 ADL公司)，OPG ELISA Kit(美國ADL公司)。

1.2 方法

1.2.1 人BMSCs分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)形成OB 骨髓標(biāo)本取自5例多發(fā)性骨髓瘤患者，密度梯度離心法分離單個核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為109·L－1，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，放入37℃，0.05 CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)5 d后首次換液，以后每3天換液，每日倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。當(dāng)細(xì)胞匯合到70%～80%時(約2周)，用0.0025胰蛋白酶消化，按1∶2比例傳代。本實(shí)驗(yàn)采用Kadiyala等［1］建立的OB誘導(dǎo)方法，將培養(yǎng)至第3代(約20 d)BMSCs采用條件培養(yǎng)基(維生素C 50 mg·L－1、地塞米松10－8mol·L－1和 β-甘油磷酸鈉 10 mmol·L－1的低糖DMEM)培養(yǎng)基培養(yǎng)，采用堿性磷酸酶染色及鈣結(jié)節(jié)等鑒定確認(rèn)為OB。

1.2.2 唑來膦酸對OB增殖的影響 上述“1.2.1”實(shí)驗(yàn)收獲的細(xì)胞采用低糖DMEM培養(yǎng)基制備5×107～10×107·L－1細(xì)胞懸液，接種于無菌 96 孔板中，每孔100 μl，含1×104個細(xì)胞。各實(shí)驗(yàn)組加入等體積不同濃度的唑來膦酸，混勻，使唑來膦酸終濃度分別為 10－9、10－8、10－7、10－6、10－5mol·L－1，每組設(shè)5個平行孔。對照組為不加唑來膦酸(0 mol·L－1)，空白組為只加培養(yǎng)液不加細(xì)胞，分別在37℃培養(yǎng)箱中孵育24、48、72 h后，向各孔中加入10 μl的CCK-8溶液終止反應(yīng)，37℃孵育2 h，測定波長450nm處OD值。

1.2.3 堿性磷酸酶檢測 上述“1.2.1”實(shí)驗(yàn)收獲的細(xì)胞采用低糖DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度109·L－1，取2 ml分別接種到放有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板，取2孔加入終濃度10－5mol·L－1唑來膦酸，對照組不加唑來膦酸(0 mol·L－1)，放入37℃，0.05 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，于72 h后取出細(xì)胞爬片，采用BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒檢測堿性磷酸酶。

1.2.4 唑來膦酸對OB RANKL/OPG mRNA表達(dá)影響檢測

1.2.4.1 唑來膦酸處理培養(yǎng)的細(xì)胞 上述“1.2.1”實(shí)驗(yàn)收獲的細(xì)胞采用低糖DMEM培養(yǎng)基懸浮，分6組，各實(shí)驗(yàn)組加入等體積不同濃度的唑來膦酸，混勻，使唑來膦酸終濃度分別為 10－9、10－8、10－7、10－6、10－5mol·L－1，對照組不加唑來膦酸(0 mol·L－1)，分別在 37℃培養(yǎng)箱中孵育 24、48、72 h后收獲所有細(xì)胞懸液，離心，上清保存于－80℃低溫冰箱，準(zhǔn)備用ELISA檢測sRANKL和OPG濃度，沉淀的細(xì)胞提取RNA。

1.2.4.2 總RNA提取與定量 沉淀的細(xì)胞用低糖DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，加入1 ml TRIzol，用紫外分光光度計準(zhǔn)確定量，測定結(jié)果OD260∶OD280＞1.8，根據(jù)A260nm計算RNA濃度，調(diào)整RT-PCR反應(yīng)體系中RNA濃度。

1.2.4.3 引物 RANKL、OPG 和 GAPDH 引物序列根據(jù)GenBank的基因序列用引物設(shè)計軟件Primer Premer設(shè)計，并由上海生物工程有限公司合成。RANKL(486 bp):上游引物:+5'GCCAGTGGGAGATGTTAG3'， 下 游 引 物:-5'TTAGCTGCAAGTTTTCCC3';OPG(324 bp):上游引物:+5'GCTAACCTCACCTTCGAG3'，下游引物:-5'TGATTGGACCTGGTTACC3';GAPDH(206 bp):上游引物:+5'GGAGTCAACGGATTTGGT3'，下游引物:－5'GTGATGGGATTTCCATTGAT3'。

1.2.4.4 逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增 按照試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，總RNA加樣量均為1 μg。PCR反應(yīng)條件分別為:RANKL:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60 ℃退火50 s，72 ℃ 延伸1 min，35 個循環(huán)后72℃延長10 min。OPG:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)后72℃延長10 min。同時以GAPDH的cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物作為內(nèi)參照，擴(kuò)增條件同各個目的基因。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像自動分析儀下照相，并計算RANKL/GAPDH和OPG/GAPDH灰度比值。

1.2.5 培養(yǎng)上清檢測sRANKL和OPG 唑來膦酸處理后的細(xì)胞培養(yǎng)液上清，ELISA法檢測sRANKL和OPG濃度，方法按試劑盒說明書。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 不同藥物濃度處理組數(shù)據(jù)比較采用 SPSS11.5 for Windows中的 One-way ANOVA統(tǒng)計法分析;各種統(tǒng)計圖采用SPSS11.5 for Windows及Microsoft Excel統(tǒng)計軟件獲得。

2 結(jié)果

2.1 唑來膦酸對OB增殖的影響 唑來膦酸使OB的CCK-8實(shí)驗(yàn)吸光值呈不同程度升高。大體上，唑來膦酸濃度越高，作用時間越長，吸光值升高越明顯，但不呈線性關(guān)系。見Fig 1。

Fig 1 OD in OB CCK-8 assay(n=5)

2.2 唑來膦酸對OB堿性磷酸酶染色影響 與未經(jīng)唑來膦酸處理的OB比較，加唑來膦酸10－5mol·L－1干預(yù)72 h后細(xì)胞數(shù)量明顯增多，堿性磷酸酶染色陽性增加。見Fig 2。

Fig 2 OB alkaline phosphatase staining ×200，scale bar=50μm

2.3 唑來膦酸對MM OB RANKL/OPG mRNA表達(dá)的影響

2.3.1 唑來膦酸對MM OB RANKL mRNA表達(dá)影響 MM OB經(jīng)唑來膦酸處理后，RT-PCR檢測RANKL mRNA表達(dá)，結(jié)果見 Fig 3，4。用 ELISA檢測OB培養(yǎng)上清液sRANKL濃度，結(jié)果見Fig 4。如Fig 3，4，唑來膦酸作用24和48 h后，OB RANKL mRNA表達(dá)變化不明顯。作用72 h，低濃度(10－9mol·L－1)唑來膦酸顯示能降低RANKL mRNA表達(dá)，與對照(0 mol·L－1)比較，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。OB培養(yǎng)上清的sRANKL濃度也呈現(xiàn)類似的變化。

Fig 3 RANKL mRNA expression in OB after zoledronic acid treatment for 24，48 and 72 h

Fig 4 RANKL mRNA expression in OB and culture medium sRANKL concentration after zoledronic acid treatment for 24，48 and 72 h.

2.3.2 唑來膦酸對OB OPG mRNA表達(dá)影響 MM OB經(jīng)唑來膦酸處理后，RT-PCR檢測OPG mRNA表達(dá)，結(jié)果見Fig 5，6。用ELISA檢測OB培養(yǎng)上清液OPG濃度，結(jié)果見Fig 6。唑來膦酸作用24 h后，OB OPG mRNA表達(dá)變化不明顯。作用48 h，呈不同程度增加，以 10－8mol·L－1濃度最明顯，與對照(0 mol·L－1)比較，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。作用72 h，呈不同程度增加，以 10－7mol·L－1濃度最明顯，與對照(0 mol·L－1)比較，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。OB培養(yǎng)上清的OPG濃度也呈現(xiàn)類似的變化。

Fig 5 OPG mRNA expression in OB after zoledronic acid treatment for 24，48 and 72 h

3 討論

MBD的機(jī)制是OC活性增強(qiáng)，OB活性減低。二膦酸鹽是MBD的主要治療藥物，二膦酸鹽是一類與內(nèi)源性焦磷酸鹽結(jié)構(gòu)相似的化合物，與骨質(zhì)中羥磷灰石呈高親和力，能優(yōu)先被轉(zhuǎn)運(yùn)到骨形成或吸收加速的部位，一旦沉積到骨表面，就會被具有破骨作用的OC攝取，其作用機(jī)制通過抑制OC活化和增生來抑制骨吸收，減少骨基質(zhì)生長因子的釋放或抑制癌細(xì)胞黏附于骨基質(zhì)。MM的OB活性下降，新骨形成障礙受到廣泛關(guān)注。目前還沒有證據(jù)說明二膦酸鹽能促進(jìn)MM患者OB活性的恢復(fù)。為此，我們在MM患者的骨髓BMSCs誘導(dǎo)生成的OB加入唑來膦酸，研究其對OB增殖的影響。

我們采用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞的增殖變化，結(jié)果顯示:唑來膦酸使OB的實(shí)驗(yàn)吸光值呈不同程度升高。大體上唑來膦酸濃度越高，作用時間越長，吸光值升高越明顯，但不呈線性關(guān)系。通過OB堿性磷酸酶染色檢測，也發(fā)現(xiàn)經(jīng)過唑來膦酸處理的OB比對照組數(shù)目明顯增多，堿性磷酸酶陽性率也升高。

Fig 6 OPG mRNA expression in OB and culture medium OPG concentration after zoledronic acid treatment for 24，48 and 72 h

Im等［2］曾報告，以人骨小梁取材細(xì)胞原代培養(yǎng)(體內(nèi))及MG-63 OB系(體外)作為研究對象，采用不同濃度二膦酸鹽作用不同時間后，發(fā)現(xiàn)二膦酸鹽比空白對照組能夠明顯增加細(xì)胞的數(shù)量。我們的研究結(jié)果與之相仿，提示二膦酸鹽可能有促進(jìn)MM患者OB活性恢復(fù)的作用。

唑來膦酸促進(jìn)OB增殖的機(jī)制還不清楚。b-FGF和BMP-2被認(rèn)為是一種潛在的骨傳導(dǎo)和生長因子，參與間充質(zhì)前體細(xì)胞募集﹑增殖及分化，最終導(dǎo)致骨組織的生成。Cbfa-1是runt家族的轉(zhuǎn)錄因子，在骨形成起到關(guān)鍵作用，它被認(rèn)為是OB分化的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子。Mundy等［3］認(rèn)為二膦酸鹽通過誘導(dǎo)BMP-2的表達(dá)刺激OB。von Knoch等［4］的實(shí)驗(yàn)表明雙膦酸鹽可能促進(jìn)BMP-2和Cbfa-1等關(guān)鍵的成骨形成轉(zhuǎn)錄因子，通過作用一連串的增殖啟動，從而導(dǎo)致BMSCs向OB的定型、分化和成熟。

RANKL/OPG是OC的重要調(diào)節(jié)因子，在MBD中RANKL mRNA表達(dá)上調(diào)，OPG mRNA表達(dá)下調(diào)，RANKL/OPG主要由OB產(chǎn)生。我們研究表明，唑來膦酸對RANKL mRNA表達(dá)的影響較小，24 h和48 h時各濃度組對RANKL表達(dá)都沒有影響，72 h時10－9mol·L－1濃度組RANKL表達(dá)降低。唑來膦酸對OPG表達(dá)的影響較明顯，作用48和72 h后，表達(dá)呈不同程度增加，作用48 h時以10－8mol·L－1濃度組增加最明顯，作用72 h時以10－7mol·L－1濃度組增加最明顯。

上述結(jié)果顯示唑來膦酸可能下調(diào)OB RANKL mRNA表達(dá)，上調(diào)OB OPG mRNA表達(dá)，以后一種作用更為明顯。我們注意到唑來膦酸的作用不是濃度依賴性，也不是時間依賴性，其可靠性可能受到質(zhì)疑。不過我們同時檢測培養(yǎng)上清中的RANKL/OPG濃度，其變化規(guī)律與OB mRNA的表達(dá)相吻合，支持唑來膦酸對RANKL/OPG mRNA表達(dá)起保護(hù)骨的作用。

［1］ Kadiyala S，Young R G，Thiede M A，Bruder S P.Culture expanded canine mesenchymal stem cells possess osteochondrogenic potential in vivo and in vitro［J］.Cell Transplant，1997，6(2):125－34.

［2］ Im GI，Qureshi SA，Kenney J，et al.Osteoblast proliferation and maturation by bisphosphonates［J］.Biomaterials，2004，25(18):4105－15.

［3］ Mundy G，Garrett R，Harris S，et al.Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins［J］.Science，1999，286(5446):1946－9.

［4］ Von Knoch F，Jaquiery C，Kowalsky M，et al.Effects of bisphosphonates on proliferation and osteoblast differentiation of human bone marrow stromal cells［J］.Biomaterials，2005，26(34):6941－9.