王 艷，林禮務(wù)，陳志奎，薛恩生，楊 菁，俞麗云

眼鏡蛇毒是一類天然毒性物質(zhì)，含有多種蛋白質(zhì)、多肽、酶類等，具有廣泛的生物學(xué)活性。其中眼鏡蛇毒細(xì)胞毒素(cobra venom cytotoxin，CTX)是眼鏡蛇毒的主要成分之一，是一類既具有心臟毒性，又具有細(xì)胞毒性尤其是對(duì)腫瘤細(xì)胞有毒性的組分，在抗腫瘤方面具有一定的應(yīng)用前景。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是許多化療藥物發(fā)揮抗腫瘤作用的主要機(jī)制。我們采用CTX在體外作用于人肝癌細(xì)胞BEL-7404，從分子水平觀察CTX對(duì)人肝癌細(xì)胞的凋亡作用以及對(duì)線粒體及細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞色素C的影響，探討CTX的抗癌機(jī)制，從而為CTX治療肝癌提供更充足的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人肝癌細(xì)胞系BEL-7404(由福建省肝膽外科研究所惠贈(zèng))。

1.1.2 主要試劑 CTX由本研究所從中華眼鏡蛇毒粗毒(廣州新源蛇毒公司)中分離純化而得［1］;BCA蛋白測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程公司);RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Gibco公司);小鼠抗人Cytochrome C，β-actin單克隆抗體，兔抗人 caspase-3、-9多克隆抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠二抗、兔抗小鼠二抗(Santa Cruz公司產(chǎn)品);caspase-3、-9活性檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞增殖試驗(yàn)與光鏡觀察 將BEL-7404細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，以1×109·L－1濃度接種于96孔板(每孔100 μl)，每孔加入用完全培養(yǎng)基配制成終濃度為0.5、1、2 和3 mg·L－1的眼鏡蛇毒細(xì)胞毒素200 μl，對(duì)照組加入等量完全培養(yǎng)液，每個(gè)藥物濃度設(shè)3個(gè)平行孔，藥物作用12、24和48 h后，MTT法［2］檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(%)和半數(shù)抑制濃度(IC50)。并在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變。

1.2.2 腫瘤細(xì)胞凋亡檢測(cè) 用末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)標(biāo)記凋亡細(xì)胞。收集腫瘤細(xì)胞，分3個(gè)組，分別為生理鹽水組、CTX 1 mg·L－1組和 CTX 3 mg·L－1組，作用時(shí)間為24 h。結(jié)果判定:凋亡陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒。400倍高倍顯微鏡下，隨機(jī)觀察5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，計(jì)算出凋亡細(xì)胞的百分率。即凋亡指數(shù)(AI)/%=(TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.3 透射電鏡觀察 收集分別經(jīng)對(duì)照組及CTX 1 mg·L－1和 CTX 3 mg·L－1處理24 h 的 BEL-7404細(xì)胞各1×106個(gè)，3%戊二醛固定，2 500 r·min－1離心，去上清，細(xì)胞團(tuán)經(jīng)1%鋨酸后固定、脫水、浸透、包埋、超薄切片、鈾－鉛復(fù)染后，透射電鏡下觀察。

1.2.4 caspase-3、-9 活性檢測(cè) 收集分別經(jīng) 0、1、2和3 mg·L－1的CTX處理24 h的BEL-7404細(xì)胞各1×106個(gè)，用試劑盒提供的裂解液懸浮，冰上孵育10 min，4 ℃、14 000 ×g離心1 min，收集上清，Bradford法進(jìn)行蛋白定量，調(diào)整蛋白濃度為1×103mg·L－1，取檢測(cè)緩沖液 80 μl加 caspase-3 或 caspase-9 10 μl，再加入 Ac-DEVD-ρNA(2 mol·L－1)10 μl后混勻，37℃遮光孵育1～2 h，發(fā)現(xiàn)顏色變化比較明顯時(shí)即可測(cè)定A405。樣品的A405扣除空白對(duì)照的A405，即為樣品中caspase-3催化產(chǎn)生的ρNA的吸光度。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的對(duì)比就可以計(jì)算出樣品中催化產(chǎn)生了多少量的ρNA。計(jì)算:活化倍數(shù)=試驗(yàn)組ρNA值/對(duì)照組ρNA值。

1.2.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞色素 C 和 caspase-3、-9蛋白的表達(dá) 線粒體/細(xì)胞質(zhì)蛋白提取:分別收集1和3 mg·L－1的CTX處理24 h的BEL-7404細(xì)胞，600×g離心5 min，棄上清，細(xì)胞沉淀用細(xì)胞質(zhì)提取緩沖液重懸，Dounce勻漿器破碎細(xì)胞，700×g離心10 min，收集上清，10 000×g離心30 min，上清液為細(xì)胞質(zhì)成分。沉淀為線粒體成分，用線粒體提取緩沖液重懸，渦旋混合器混合10 s。Bradford法對(duì)提取的蛋白進(jìn)行定量，以40 μg蛋白上樣量進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，漂洗后一抗，二抗孵育，洗膜后加入顯色劑顯色。每個(gè)樣本重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 眼鏡蛇毒細(xì)胞毒素抗腫瘤細(xì)胞增殖作用 體外培養(yǎng)的人肝癌BEL-7404與眼鏡蛇毒細(xì)胞毒素孵育后，部分細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落(Fig 1A)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和劑量的增大，壞死的細(xì)胞越來越多(Fig 1B)，具有明顯的劑量依賴效應(yīng)和時(shí)間依賴效應(yīng)。而對(duì)照組人肝癌BEL-7404卻貼壁生長(zhǎng)良好，僅個(gè)別細(xì)胞貼壁能力降低，漂浮起來(Fig 1C)。眼鏡蛇毒細(xì)胞毒素對(duì)人肝癌BEL-7404細(xì)胞12、24和48 h 的 IC50分別為 2.56、1.94 和 1.35 mg·L－1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見Tab 1。

Tab 1 Cytotoxic effect of CTX on BEL-7404 in vitro ± s，%)

Tab 1 Cytotoxic effect of CTX on BEL-7404 in vitro ± s，%)

*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs 12 h group;△P＜0.05 vs 24 h group

Concentration/mg·L－112 h 24 h 48 h Control 0.12 ±0.03 0.57 ±0.11 1.21 ±0.17 0.5 15.71 ±2.67* 24.36 ±2.54# 29.42 ±1.87△1 27.85 ±1.87* 39.82 ±1.15# 43.36 ±2.35△2 39.62 ±2.15* 52.37 ±1.65# 61.54 ±1.46△3 57.39 ±2.33* 69.43 ±2.27# 80.32 ±2.33△

2.2 腫瘤細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 生理鹽水組TUNEL標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較少，AI值為5.3%，給藥組TUNEL標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多，CTX 1 mg·L－1組和CTX 3 mg·L－1組 AI值分別為 38.5%和77.8%。

2.3 透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變 透射電鏡下觀察對(duì)照組細(xì)胞細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞膜完整，核仁清晰，染色質(zhì)均勻分布于細(xì)胞核內(nèi)，胞質(zhì)內(nèi)線粒體等細(xì)胞器清晰可見(Fig 2A)。給藥組大部分腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡征象:如線粒體明顯腫脹，部分溶解(Fig 2B)，細(xì)胞膜皺縮、染色質(zhì)固縮、核仁裂解為大小不均一的碎塊(Fig 2C)。

Fig 1 BEL-7404 proliferation inhibited by CTX in vitroA:BEL-7404 treated for 2 h;B:BEL-7404 treated for 48 h;C:control

Fig 2 Apoptotic morphological changes of BEL-7404 treated by CTX

2.4 caspases酶活性的影響 給藥組caspase-3，-9酶活性均有提高，且隨著濃度的增加，活化的倍數(shù)隨著提高，見Tab 2。

Tab 2 Enzyme activity of caspase-9，-3 increased by CTX in BEL-7404

2.5 Western blot檢測(cè)結(jié)果

2.5.1 細(xì)胞色素C(Cytochrome C)分布變化 對(duì)照組線粒體內(nèi)Cytochrome C表達(dá)較多，CTX組表達(dá)量較少，且3 mg·L－1劑量組與空白對(duì)照組相比更為明顯。而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Cytochrome C表達(dá)則相反，對(duì)照組表達(dá)較少，CTX組表達(dá)量增加，且3 mg·L－1劑量組與空白對(duì)照組相比更為明顯(Fig 3)。

Fig 3 Expression of cytochrome C proteins in each group

2.5.2 caspase-3、-9蛋白的表達(dá) 對(duì)照組 caspase-3、-9蛋白僅少量表達(dá)，CTX組表達(dá)量增多，且3 mg·L－1劑量組與空白對(duì)照組相比更為明顯(Fig 4)。

3 討論

細(xì)胞凋亡是一種重要生物學(xué)過程，是由于內(nèi)外環(huán)境變化或死亡信號(hào)觸發(fā)，在相關(guān)基因調(diào)控下引起的細(xì)胞主動(dòng)死亡過程。在細(xì)胞凋亡機(jī)制研究中，目前認(rèn)為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡主要有兩條途徑:一條是死亡受體途徑;另一條是線粒體凋亡途徑［3］。線粒體在凋亡早期先于核或染色體的改變即出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能的變化，已研究證實(shí)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(MPTP)開放是細(xì)胞凋亡的重要環(huán)節(jié)［4－5］。在致凋亡因子的刺激下，細(xì)胞線粒體跨膜電位降低或喪失［6－7］，線粒體釋放細(xì)胞色素 C和凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)至細(xì)胞質(zhì)中［8－9］，它們可與凋亡相關(guān)蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)結(jié)合，在有脫氧三磷酸腺苷(dATP)存在的情況下，激活 Apaf-1［10］，活化的Apaf-1可以結(jié)合caspase-9酶原而將其切割和活化。caspase-9處于caspase“瀑布式”激活的頂端，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡過程的啟動(dòng)［11］?；罨腸aspase-9裂解后可激活caspase-3和下游眾多的caspase蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)。其中caspase-3被認(rèn)為是級(jí)聯(lián)反應(yīng)中最關(guān)鍵的效應(yīng)蛋白酶，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路［12－13］?；罨腸aspase-3引起caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，完成整個(gè)細(xì)胞凋亡和清除過程，包括DNA片段化、染色體固縮、細(xì)胞膜水泡樣變、細(xì)胞皺縮并向內(nèi)形成凋亡小體，最終引起染色體DNA及細(xì)胞的解體［14］。

Fig 4 Expression of caspase proteins in each group

本研究中證實(shí)CTX具有較強(qiáng)的毒性作用，可誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡，且具有明顯的劑量依賴效應(yīng)和時(shí)間依賴效應(yīng)。給藥組線粒體明顯腫脹，細(xì)胞色素C從線粒體釋放到胞質(zhì)增多，提示腫瘤細(xì)胞凋亡可能與線粒體參與的途徑有關(guān)。給藥組caspase-3、-9表達(dá)增加，酶活性明顯增高均提示:caspase-3、-9參與了線粒體凋亡途徑。我們認(rèn)為CTX首先通過線粒體細(xì)胞色素C釋放，進(jìn)一步誘導(dǎo)效應(yīng)性caspase-9、-3蛋白酶激活，最終誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡，這可能是其在體內(nèi)產(chǎn)生抗腫瘤作用的機(jī)制之一。

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