張 鳳，金松南，文今福

(泰山醫(yī)學(xué)院1.動(dòng)脈粥樣硬化研究所、2.藥學(xué)院藥物研究所，山東 泰安 271000)

目前內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)與心血管疾病的關(guān)系倍受關(guān)注［1－2］。眾所周知，左心房是體循環(huán)的初級(jí)泵，在機(jī)體的血液循環(huán)中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，而其功能異常與多種心血管疾病如高血壓、房顫、心肌缺血等密切相關(guān)。近來研究表明［3］，左心房中eNOS基因表達(dá)減弱可誘導(dǎo)房顫的發(fā)生和發(fā)展。然而，甲亢性高血壓病理狀態(tài)下左心房中eNOS基因表達(dá)和血漿NO水平的動(dòng)態(tài)變化尚不清楚。本研究旨在探討甲亢性高血壓病理狀態(tài)下左心房中eNOS基因表達(dá)和血漿NO水平變化，為甲亢性高血壓的防治提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 新西蘭大耳白家兔由山東省濟(jì)寧魯抗公司提供，體質(zhì)量2.2～2.5 kg。家兔隨機(jī)分4組，分別為對(duì)照組12 d組，L-甲狀腺素(T4)注射12 d組，每組6只。甲亢組皮下注射 T4，其劑量為 0.5 mg·kg－1·d－1，對(duì)照組皮下注射等體積的生理鹽水。

1.2 試劑 NO試劑盒(南京建成生物工程研究所);TRIzol(Invitrogen公司)，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)，TaqDNA聚合酶(Solarbio公司)，RT-PCR引物由Invitrogen公司合成。

1.3 血壓和心率檢測(cè) 用1%戊巴比妥鈉溶液麻醉家兔，仰臥位固定，頸部正中皮膚做7 cm長(zhǎng)縱形切口，行氣管插管，用玻璃分針剝開左側(cè)頸動(dòng)脈鞘，并分離頸總動(dòng)脈，插入充有肝素的動(dòng)脈插管，經(jīng)壓力換能器將血壓和心率變化輸入配有BL-420E系統(tǒng)的電腦進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄和處理。

1.4 RT-PCR法檢測(cè)左心房eNOS基因表達(dá) 利用TRIzol試劑提取總RNA，并進(jìn)行RNA純度和濃度檢測(cè)。cDNA的合成參照逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增試劑盒操作程序進(jìn)行。PCR分析:GAPDH作為內(nèi)參，靶基因?yàn)閑NOS，引物序列為5'-TACAGACAGCAGGAGGGTTC-3'和5'-TCTCCGTGCTCATGTACCAG-3'。將PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，置于凝膠成像系統(tǒng)成像。以目的基因光密度值與內(nèi)參基因光密度值的比值作為該樣品中目的基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量。

1.5 血漿中NO檢測(cè) 心臟取血，經(jīng)離心獲取血漿。硝酸還原酶法測(cè)定血漿NO含量，按照試劑盒說明書操作(最大吸收峰550 nm處測(cè)定吸光度)，單位為μmol·L－1。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以ˉ±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 T4注射對(duì)家兔血壓、心率和左心房質(zhì)量的影響 與對(duì)照組相比，T4注射12d組收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、平均動(dòng)脈壓(MAP)和心率(HR)均升高(P＜0.05)(Tab 1)。

Tab 1 Changes in blood pressure and heart rate in sham and T4-treated rabbits(ˉ±s，n=6)

Tab 1 Changes in blood pressure and heart rate in sham and T4-treated rabbits(ˉ±s，n=6)

GroupSBPDBPMAPHR(12 d)/kPa/kPa/kPa/time·min －1 Sham 15.7 ±0.4 11.0 ±0.4 12.6 ±0.5 260.9 ±1.4 T4-treated 20.4 ±0.5＊＊13.1 ±0.6* 15.5 ±0.7* 411.9 ±3.8＊＊

2.2 甲亢性高血壓家兔模型中左心房eNOS mRNA表達(dá)水平變化 以GAPDH作為內(nèi)參照，eNOS mRNA表達(dá)量的光密度掃描分析顯示，甲亢組eNOS mRNA水平(0.22±0.01)低于對(duì)照組(0.13±0.01)，n=3，P＜0.01。

2.3 甲亢性高血壓家兔模型中血漿NO水平變化 用硝酸還原酶法檢測(cè)血漿NO水平結(jié)果，甲亢組血漿 NO水平(67.89±13.14)μmol·L－1高于對(duì)照組(53.12 ±9.52)μmol·L－1，n=6，P ＜0.01。3 討論

心血管系統(tǒng)是甲狀腺激素作用的重要靶器官，出現(xiàn)甲亢時(shí)由于甲狀腺激素過量，交感神經(jīng)興奮，腎素－血管緊張素系統(tǒng)激活，從而導(dǎo)致心血管功能紊亂［4－5］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比T4注射12 d后收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓和心率均升高，表明T4注射12 d能誘導(dǎo)甲亢性高血壓模型。

NO是機(jī)體內(nèi)一種作用廣泛的氣體信號(hào)分子，具有降血壓、擴(kuò)血管、抗心肌肥厚和抗炎等多種生物學(xué)效應(yīng)［6－8］。已有研究證實(shí)［9］，心室肌eNOS基因表達(dá)下調(diào)和NO生成減少與自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)血壓升高關(guān)系密切。本實(shí)驗(yàn)中分析左心房eNOS基因表達(dá)結(jié)果，甲亢組eNOS基因水平明顯低于對(duì)照組，提示此變化與左心房功能紊亂密切相關(guān)而易產(chǎn)生房顫。本實(shí)驗(yàn)中分析血漿NO水平結(jié)果，甲亢組血漿NO水平高于對(duì)照組，這可能與甲亢時(shí)血流切應(yīng)力升高而血管內(nèi)皮釋放的NO增多有關(guān)，是機(jī)體的一種代償性保護(hù)機(jī)制。雖然甲亢組血漿NO水平高于對(duì)照組，但仍處于嚴(yán)重的高血壓狀態(tài)，其原因可能是由于高血壓病理狀態(tài)下NO的生物利用度降低，此時(shí)應(yīng)有足夠量的NO才能夠逆轉(zhuǎn)其病情。

綜上所述，本研究觀察到甲亢性高血壓病理狀態(tài)下左心房eNOS基因表達(dá)下調(diào)和血漿NO水平升高現(xiàn)象，提示甲亢性高血壓病理狀態(tài)下左心房eNOS基因表達(dá)下調(diào)與左心房功能紊亂密切相關(guān)。

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