孔曉霞 李夢楠 朱雯婷 李 超 秦 臻 張 婷

(溫州醫(yī)學院低氧醫(yī)學研究所 機能實驗教學中心，浙江 溫州 325035)

低氧(Hypoxia)是許多惡性疾病的重要病理生理特征之一，大約有90%的實質性腫瘤中都存在低氧現(xiàn)象。適度的低氧環(huán)境可激發(fā)機體一系列內在的適應性過程，不但可以維持細胞的正常功能，而且對抵抗機體損傷具有一定作用〔1〕。自噬(Autophagy)是細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質的過程〔2〕。在低氧或者營養(yǎng)缺乏時，細胞能夠通過自噬方式獲取ATP以及其他保證基本代謝過程的營養(yǎng)物質，從而拮抗損傷，對細胞生存具有保護作用〔3〕。但是，過度激活的自噬會引起程序性細胞死亡，導致細胞生存率下降，這種細胞死亡方式被定義為自噬型細胞死亡〔4〕。可見，自噬在細胞分化和增殖中的作用依然存在著廣泛的爭議。本研究通過探討低氧條件對順鉑(DDP)抗腫瘤效應的影響及細胞自噬的作用，以進一步闡明低氧和腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人非小細胞肺癌A549細胞株由溫州醫(yī)學院機能實驗中心保存。

1.1.2 儀器與試劑 激光共聚焦顯微鏡(FV1000型，日本O-lympus)觀察A549細胞熒光染色結果;酶標儀(美國Thermo公司)用于亞甲基四唑藍(MTT)法檢測細胞生存率。細胞培養(yǎng)用1640培養(yǎng)液以及新生牛血清購于美國Hyclone公司。DDP及免疫熒光染料(MDC)、熒光染料(Hoechst33342)均購于美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 A549細胞培養(yǎng) A549細胞置于完全培養(yǎng)基(10%新生牛血清，1640培養(yǎng)液，pH7.4)中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d用0.25%胰酶消化后，換液傳代培養(yǎng)用于后續(xù)實驗。

1.2.2 MTT法測定細胞生存率 取對數(shù)生長期A549細胞，經消化制成細胞懸液，以每孔100 μl，1×104細胞數(shù)接種于96孔板，24 h后按實驗分組加入 10 μmol/L DDP和 20 μmol/L DDP，分別放入常氧(20%O2)和低氧培養(yǎng)箱(1%O2)。在8 h后加入MTT(5 mg/ml)20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸出培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，振蕩 10 min，570 nm 測其吸光度值。實驗重復3次。

1.2.3 MDC染色檢測細胞自噬空泡變化 MDC是一種自噬空泡的標志物，可以通過MDC染色觀察判斷細胞自噬過程的發(fā)生。以4%預冷的多聚甲醛，4℃下固定15 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2遍，加入終濃度為50 μmol/L的 MDC染色液，37℃孵育60 min，PBS洗2遍。激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞自噬空泡的變化。

1.2.4 Hoechst33342染色檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期A549細胞，經消化制成細胞懸液，以每孔5×104細胞數(shù)接種于24孔板中，細胞貼壁后，按照實驗分組在藥物處理后12 h，PBS洗2遍，棄上清，加入終濃度1 μg/ml的 Hoechst33342染色，37℃孵育15 min，PBS洗2遍，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞染色質凝集及形態(tài)變化。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以表示，多組間比較使用單因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 結果

2.1 常氧和低氧條件下DDP對A549細胞增殖率的影響 在常氧條件下，單獨應用DDP作用于A549細胞12 h，細胞增殖率明顯下降，并呈劑量依賴性;而在低氧條件下，DDP對A549細胞的損傷作用明顯降低，細胞死亡率與常氧條件下的DDP組相比明顯降低(P﹤0.05)。見圖1。

圖1 常氧和低氧條件下DDP對A549細胞增殖率的影響

2.2 MDC染色檢測細胞自噬空泡變化 單獨應用10 μmol/L DDP作用于A549細胞時，未見MDC熒光聚集現(xiàn)象，表明細胞內無明顯自噬空泡堆積。單獨的低氧條件下或低氧條件下應用DDP作用A549細胞12 h，細胞均出現(xiàn)大量自噬空泡積聚，表明有自噬過程發(fā)生，并有明顯差異(P＜0.05)。見圖2。

2.3 Hoechst33342染色檢測細胞凋亡 單獨應用DDP作用A549細胞12 h，細胞核碎裂，染色質凝聚明顯，表明有顯著細胞凋亡過程發(fā)生;在單純低氧條件下，未見細胞核形態(tài)明顯變化，無明顯細胞凋亡發(fā)生。而低氧條件下，DDP作用A549細胞12 h，細胞染色質凝聚水平與常氧條件下DDP組相比顯著下降(P﹤0.05)，細胞損傷程度明顯降低。見圖3。

圖2 MDC染色檢測常氧或低氧條件下DDP作用A549細胞自噬空泡的變化及平均熒光強度分析(×600)

圖3 Hoechst33342染色檢測常氧和低氧條件下DDP對A549凋亡細胞核染色質濃縮的影響及平均熒光強度(×400)

3 討論

肺癌是目前全球癌癥發(fā)病率和死亡率位居第一的惡性腫瘤，探討其發(fā)生機制及有效的治療手段一直是受到廣泛關注的研究熱點之一。在正常機體中，氧濃度的變化對組織細胞的代謝、增殖、分化具有重要的調節(jié)作用。為了適應低氧條件，腫瘤細胞通過激活一系列信號機制，例如血管生成、細胞新陳代謝增強、遷移等，促進了細胞增殖、轉移、耐藥等。不僅改變了腫瘤細胞的生物學特性，引起腫瘤細胞的遺傳不穩(wěn)定性及惡性選擇，導致腫瘤發(fā)生惡性轉化甚至轉移。而且研究表明低氧也是腫瘤細胞對放療、化療產生抗性的主要原因之一〔5〕。因此，低氧作為抗腫瘤靶點的研究備受許多學者關注。已有研究表明自噬在饑餓、氧化應激、低氧等條件下對細胞具有一定程度的保護作用〔6〕。本研究提示腫瘤細胞的低氧環(huán)境可能通過某種機制降低了DDP的損傷作用。

低氧誘導因子1(HIF-1)是低氧條件下廣泛存在于哺乳動物和人體內的一種核轉錄因子，HIF-1α能夠上調BNIP3(只具有BH3區(qū)的Bcl2家族成員)的表達引起自噬蛋白Beclin 1活性增強，誘導自噬的發(fā)生，達到保護細胞的作用〔7，8〕。本實驗結果表明DDP作用A549細胞后，自噬水平變化不明顯，但低氧條件則能夠引起細胞發(fā)生自噬。常氧條件下應用DDP作用A549細胞，細胞核發(fā)生明顯皺縮，染色質凝聚。但低氧條件下，DDP對細胞核的損傷作用則顯著降低。這提示在低氧條件下，細胞自噬信號的激活，對于DDP誘導的細胞損傷可能起到了一種促增殖性的保護作用，進而降低了細胞死亡率。

以上結果表明，DDP能夠引起A549細胞發(fā)生凋亡，在低氧條件下引起的自噬降低了DDP的損傷作用，其具體機制及涉及的信號通路還有待于進一步探討。

1 Matsumoto S，Yasui H，Mitchell JB，et al.Imaging cycling tumor hypoxia〔J〕.Cancer Res，2010;70(24):10019-23.

2 Sato K，Tsuchihara K，F(xiàn)ujii S，et al.Autophagy is activated in colorectal cancer cells and contributes to the tolerance to nutrient deprivation〔J〕.Cancer Res，2007;67(20):9677-84.

3 Mizushima N，Levine B，Cuervo AM，et al.Autophagy fights disease through cellular self-digestion〔J〕.Nature，2008;451(7182):1069-75.

4 Abedin MJ，Wang D，McDonnell MA，et al.Autophagy delays apoptotic death in breast cancer cells following DNA damage〔J〕.Cell Death Differ，2007;14(3):500-10.

5 Degenhardt K，Mathew R，Beaudoin B，et al.Autophagy promotes tumor cell survival and restricts necrosis，inflammation，and tumorigenesis〔J〕.Cancer Cell，2006;10(1):51-64.

6 Cosse JP，Michiels C.Tumour hypoxia affects the responsiveness of cancer cells to chemotherapy and promotes cancer progression〔J〕.Anticancer Agents Med Chem，2008;8(7):790-7.

7 Azad MB，Chen Y，Henson ES，et al.Hypoxia induces autophagic cell death in apoptosis-competent cells through a mechanism involving BNIP3〔J〕.Autophagy，2008;4(2):195-204.

8 Zhang H，Bosch-Marce M，Shimoda LA，et al.Mitochondrial autophagy is an HIF-1-dependent adaptive metabolic response to hypoxia〔J〕.J Biol Chem，2008;283(16):10892-903.