韓玲玲， 李 佳， 陳 穎， 王 威， 張 丹， 劉國(guó)良△

(1中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，遼寧 沈陽(yáng) 110001;2中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院內(nèi)分泌科，遼寧 沈陽(yáng) 110032;3沈陽(yáng)市93303部隊(duì)醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110043)

2型糖尿病發(fā)生的兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)是胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能衰竭。研究表明，高游離脂肪酸血癥是肥胖引發(fā)胰島素抵抗的重要致病因素。游離脂肪酸抑制基礎(chǔ)狀態(tài)和胰島素刺激后的組織攝取與利用葡萄糖，造成組織對(duì)胰島素的敏感性降低。骨骼肌是機(jī)體葡萄糖、脂質(zhì)攝取和利用的重要器官，因而骨骼肌的脂肪沉積與骨骼肌胰島素抵抗的關(guān)系受到越來(lái)越多的關(guān)注［1，2］。本研究將給予原代培養(yǎng)的大鼠成肌細(xì)胞不同劑量棕櫚酸(palmitic acid，PA)處理不同時(shí)間，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞活力、甘油三酯在細(xì)胞中的沉積及含量，以及葡萄糖攝取的變化，以探討棕櫚酸造成大鼠成肌細(xì)胞的脂毒性，并進(jìn)一步研究其對(duì)成肌細(xì)胞糖代謝的影響。

材料和方法

1 主要儀器與試劑

超凈工作臺(tái)(蚌埠凈化設(shè)備廠)，CO2孵箱(Forma Scientific)，超高速離心機(jī)(Sanyo)，倒置相差顯微鏡(Nikon)，低溫離心機(jī)(Sigma)，負(fù)壓吸引器(Millipore)，酶標(biāo)儀(Bio－Rad)，多功能液閃發(fā)光測(cè)定儀(Perkinelmer)。

PA(Sigma)，DMEM 和胎牛血清(HyClone)，膠原酶Ⅰ和牛血清白蛋白(Sigma)，油紅O干粉(Solarbio)，兔抗大鼠α－肌動(dòng)蛋白抗體、山羊抗兔多克隆抗體及過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素染色試劑盒(北京博奧森)，甘油三酯［甘油磷酸氧化酶－過(guò)氧化物酶(glycerophosphate oxidase－peroxidase，GPO －POD)法］測(cè)定試劑盒(北京普利萊)，［3H］標(biāo)記－2－脫氧 －左旋 －葡萄糖(2－deoxy－D－［3H］glucose)(Perkinelmer)，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

2 方法

2.1 大鼠成肌細(xì)胞分離、培養(yǎng)、傳代及鑒定 取Wistar乳鼠4只，在無(wú)菌條件下分離雙下肢及腹部肌肉，剪成1 mm×1 mm×1 mm小塊，I型膠原酶消化40 min后，0.25%胰蛋白酶消化30 min，過(guò)200 μm孔徑的濾網(wǎng)，1000 r/min離心10 min，棄去上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，以109cells/L的細(xì)胞密度接種于6孔板中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞。24 h后，胰酶消化，以2×109cells/L的細(xì)胞密度，重新接種于75 cm2的大培養(yǎng)瓶。以后每2－3 d換液1次。待細(xì)胞處于80% ～90%融合狀態(tài)時(shí)，用含0.25%胰蛋白酶消化液消化傳代，差速貼壁法純化。將細(xì)胞接種于24孔板后，用兔抗大鼠α－肌動(dòng)蛋白抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)鑒定，見(jiàn)圖1，成肌細(xì)胞α－肌動(dòng)蛋白在胞漿內(nèi)被染成黃色。

2.2 PA處理細(xì)胞及測(cè)定指標(biāo) 原代培養(yǎng)細(xì)胞處于80% ～90%融合狀態(tài)時(shí)用0.1、0.3、0.5 mmol/L PA處理6、12、24 h 后，用 MTT 法檢測(cè)成肌細(xì)胞活力［3］;用油紅O染色法檢測(cè)成肌細(xì)胞脂肪變性后甘油三酯沉積［4］;用GPO－POD酶法測(cè)定成肌細(xì)胞脂肪變性后甘油三酯含量［5］;用同位素示蹤法檢測(cè)2－deoxy－D －［3H］glucose攝取［6］。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用單因素方差分析(One－way ANOVA)進(jìn)行組間差異的顯著性檢驗(yàn)，兩兩比較用q檢驗(yàn)(SNK)。

Figure 1.Rat myoblast immunohistochemistry staining revealed that the cultured cells were rat myoblasts(×200).The rat α－actin was stained as yellow in the cytoplasm of myoblasts.圖1 大鼠成肌細(xì)胞的免疫組化鑒定

結(jié) 果

1 PA對(duì)成肌細(xì)胞活力的影響

如圖2所示，隨著 PA處理濃度(0.1～0.5 mmol/L)的增加及暴露時(shí)間(6～24 h)的延長(zhǎng)，成肌細(xì)胞活力不斷降低，并呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性的效應(yīng)關(guān)系。0.1 mmol/L PA未對(duì)細(xì)胞活力產(chǎn)生明顯影響，0.3 mmol/L PA暴露時(shí)間6、12 h亦未對(duì)細(xì)胞活力產(chǎn)生明顯影響，但該劑量暴露24 h使細(xì)胞活力明顯下降。0.5 mmol/L PA在3個(gè)暴露時(shí)點(diǎn)段均使細(xì)胞活力顯著下降。

Figure 2.MTT method showed the effect of PA on the cell viability of myoblasts..n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖2 MTT法檢測(cè)PA對(duì)成肌細(xì)胞活力的影響

2 PA對(duì)成肌細(xì)胞甘油三酯沉積的影響

油紅O染色細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)橘紅色的脂滴表示甘油三酯沉積。正常培養(yǎng)的細(xì)胞(未加PA)中未見(jiàn)甘油三酯沉積。如圖3所示，隨著PA暴露劑量和時(shí)間增加，甘油三酯沉積逐漸增加。但是各劑量PA組培養(yǎng)6 h，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)少量脂肪變性細(xì)胞，脂滴數(shù)量較少。除0.1 mmol/L PA培養(yǎng)12和24 h外，各組脂變細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集了較多脂滴沉積，部分脂滴融合。

Figure 3.Oil red O dyeing method showed that palmitic acid induced TG sediment in myoblasts(×400).圖3 油紅O染色顯示PA誘導(dǎo)大鼠成肌細(xì)胞甘油三酯沉積

3 PA對(duì)成肌細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量的影響

如表1所示，與對(duì)照相比，甘油三酯含量隨PA濃度增加、作用時(shí)間延長(zhǎng)而增加。在0.3 mmol/L PA(12、24 h)組和 0.5 mmol/L PA(6、12、24 h)組有明顯甘油三酯沉積。

表1 GPO－POD法測(cè)定大鼠成肌細(xì)胞中甘油三酯含量Table 1.GPO－POD method was used to determinate the triglyceride content in myoblasts(mmol/L..n=6)

表1 GPO－POD法測(cè)定大鼠成肌細(xì)胞中甘油三酯含量Table 1.GPO－POD method was used to determinate the triglyceride content in myoblasts(mmol/L..n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs 0.1 mmol/L PA;△P＜0.05 ，△△P ＜0.01 vs 6 h.

Group 6 h 12 h 24 h Control 1.023 ±0.468 1.046 ±0.320 1.053 ±0.3970.1 mmol/L PA 1.183 ±0.370 1.687 ±0.623 1.951 ±0.748＊△0.3 mmol/L PA 1.317 ±0.329 3.277 ±0.503＊＊##△△ 3.955 ±0.836＊＊##△△0.5 mmol/L PA 2.547 ±0.493＊＊## 5.725 ±0.807＊＊##△△ 6.296 ±0.596＊＊##△△

4 PA對(duì)成肌細(xì)胞糖攝取的影響

如表2所示，與對(duì)照相比，隨PA濃度升高、作用時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠成肌細(xì)胞糖攝取減低，但24和12 h無(wú)顯著差異。0.1 mmol/L PA(24 h)組、0.3 mmol/L PA(12、24 h)組及0.5 mmol/L PA(12、24 h)組的大鼠成肌細(xì)胞糖攝取顯著減低，見(jiàn)表2。

表2 同位素示蹤法檢測(cè)大鼠成肌細(xì)胞糖攝取情況Table 2.Isotope tracer method was used to detect the 2－deoxy－D－［3H］glucose uptake of rat myoblasts(10－2pmol/min..n=3)

表2 同位素示蹤法檢測(cè)大鼠成肌細(xì)胞糖攝取情況Table 2.Isotope tracer method was used to detect the 2－deoxy－D－［3H］glucose uptake of rat myoblasts(10－2pmol/min..n=3)

＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05 vs 0.1 mmol/L PA;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs 6 h.

Group 6 h 12 h 24 h Control 2.300 ±0.502 2.250 ±0.409 2.233 ±0.2940.1 mmol/L PA 2.267 ±0.468 1.950 ±0.362 1.683 ±0.264＊＊△0.3 mmol/L PA 2.183 ±0.349 1.583 ±0.534＊＊△ 1.417 ±0.299＊＊△△0.5 mmol/L PA 2.150 ±0.288 1.450 ±0.404＊＊△△ 1.183 ±0.397＊＊#△△

討 論

近年的研究表明，血清游離脂肪酸升高和甘油三酯在非脂肪組織的異位沉積與這兩個(gè)環(huán)節(jié)密切相關(guān)［7］。對(duì)糖尿病患者的非肥胖非糖尿病后代研究表明，肌細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的增多可作為導(dǎo)致胰島素抵抗發(fā)生的早期異常改變，并提示此異常改變可導(dǎo)致該個(gè)體葡萄糖攝取障礙［8］。骨骼肌是葡萄糖代謝的重要組織，骨骼肌的胰島素敏感性降低是機(jī)體胰島素抵抗的主要原因。骨骼肌脂質(zhì)分布與含量異常，及骨骼肌異位脂肪的過(guò)多沉積，被認(rèn)為是胰島素抵抗的關(guān)鍵因素之一。

本實(shí)驗(yàn)提取3 d齡Wistar大鼠的成肌細(xì)胞，進(jìn)行原代培養(yǎng)及鑒定后，應(yīng)用有代表性的游離脂肪酸－不同濃度PA誘導(dǎo)大鼠成肌細(xì)胞脂肪變性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著PA處理濃度和時(shí)間的增加，成肌細(xì)胞活力逐漸降低，甘油三酯沉積及細(xì)胞內(nèi)含量逐漸增加，葡萄糖攝取逐漸降低。本研究表明，高游離脂肪酸血癥是肥胖引發(fā)胰島素抵抗的重要致病因素，游離脂肪酸抑制基礎(chǔ)狀態(tài)和胰島素刺激后的組織攝取與葡萄糖利用，造成組織對(duì)胰島素的敏感性降低，但是其抑制骨骼肌葡萄糖攝取的環(huán)節(jié)還有待進(jìn)一步研究。有研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌組織內(nèi)增多的脂肪將比葡萄糖優(yōu)先利用，導(dǎo)致肌細(xì)胞利用葡萄糖能力下降，攝取葡萄糖減少，引起胰島素抵抗。研究還發(fā)現(xiàn)，游離脂肪酸不只是單純通過(guò)葡萄糖－脂肪酸循環(huán)與葡萄糖相互競(jìng)爭(zhēng)，可能還通過(guò)其它機(jī)制影響葡萄糖代謝。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌的脂質(zhì)代謝異常與胰島素抵抗以及糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因而異位脂肪組織可以作為臨床治療的目標(biāo)，通過(guò)不同的治療方法，減少肥胖，延緩和防止胰島素抵抗的發(fā)生、發(fā)展，以達(dá)到預(yù)防糖尿病和心血管疾病的目的。

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