陳 莉 肖若蕾

（咸寧學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100）

茜草雙酯為促進(jìn)白細(xì)胞增生藥，是茜草酸的合成類似物，對各種原因尤其是腫瘤化療所造成的白細(xì)胞減少癥有顯著的療效[1]。但茜草雙酯在水中幾乎不溶，且化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定。而以PVP為載體制備的茜草雙酯固體分散體能有效的提高茜草雙酯的溶出速率[2]，是較理想的茜草雙酯制劑。本文利用HPLC法具有方便簡捷，分離效果好，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好的優(yōu)勢，探討了茜草雙酯固體分散體中有關(guān)物質(zhì)的測定方法，以期更好地控制藥品質(zhì)量。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器與試劑

N3000高效液相色譜系統(tǒng)（北京創(chuàng)新通恒），C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），Sartoriusag BP211D電子天平（北京賽多利斯）。

茜草雙酯固體分散體（自制，每克茜草雙酯固體分散體含0.1g茜草雙酯）；茜草雙酯標(biāo)準(zhǔn)品（紫外含量測定用，中國藥品生物制品檢定所，100418-200401）；PVPK30（上?；瘜W(xué)試劑公司，040914）；乙腈為色譜純，其他為分析純，重蒸水自制。

1.2 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈∶水=70∶30；流速為1.0mL/min；紫外檢測波長為264nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量為20μL。理論塔板數(shù)為8351，重復(fù)性試驗(yàn)符合要求。

1.3 方法的專屬性考察

將茜草雙酯溶液進(jìn)行強(qiáng)堿、強(qiáng)酸、強(qiáng)氧化、光照等破壞性試驗(yàn)，考察擬訂的色譜條件下各中間體和降解產(chǎn)物分離情況。

1.3.1 強(qiáng)酸破壞試驗(yàn)

稱取茜草雙酯對照品約10mg，用20mL流動(dòng)相溶液溶解，置100mL容量瓶中，加入2.0mL的鹽酸溶液（1.0mol/L），振搖，于80℃水浴中加熱30min，取出，冷卻至室溫，用氫氧化鈉溶液（0.5mol/L）調(diào)pH=5，再用流動(dòng)相溶液稀釋至刻度，搖勻。

1.3.2 強(qiáng)堿破壞試驗(yàn)

稱取茜草雙酯對照品約10mg，用20mL流動(dòng)相溶液溶解，置100mL容量瓶中，加入2.0mL的氫氧化鈉溶液（1.0mol/L），振搖，于80℃水浴中加熱30min，取出，冷卻至室溫，用的鹽酸溶液（0.5mol/L）調(diào)pH=5后，再用流動(dòng)相溶液稀釋至刻度，搖勻。

1.3.3 氧化破壞試驗(yàn)

稱取茜草雙酯對照品約10mg，用20mL流動(dòng)相溶液溶解，置100mL容量瓶中，加入30%的過氧化氫溶液2.0mL，振搖，于80℃水浴中加熱30min，取出，冷卻至室溫，再用流動(dòng)相溶液稀釋至刻度，搖勻。

1.3.4 強(qiáng)光照射破壞試驗(yàn)

稱取茜草雙酯對照品約10mg，用適量流動(dòng)相溶液溶解，置100mL容量瓶中，置陽光下照射3h，用流動(dòng)相溶液稀釋至刻度，搖勻。

分別取上述方法破壞后的茜草雙酯溶液適量，微孔濾膜過濾，按1.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，觀察主峰與各雜質(zhì)峰的分離情況，結(jié)果如圖1。

由破壞性實(shí)驗(yàn)的高效液相色譜圖可知，在擬訂的色譜條件下，有關(guān)物質(zhì)和降解產(chǎn)物的色譜峰出峰在主峰前，有關(guān)物質(zhì)及輔料色譜峰與主成分茜草雙酯峰可以有效分離。據(jù)此，將有關(guān)物質(zhì)檢查的記錄時(shí)間擬訂為主峰保留時(shí)間的2倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：堿性條件下茜草雙酯尤其不穩(wěn)定，茜草雙酯只有極少量存在，破壞產(chǎn)物極性較強(qiáng)，在本色譜條件下，基本不保留；茜草雙酯在其他破壞性實(shí)驗(yàn)條件下有關(guān)物質(zhì)和降解產(chǎn)物也明顯增加，因反應(yīng)機(jī)理較復(fù)雜，未能確定其主要降解產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.4 線性關(guān)系試驗(yàn)

精密稱取茜草雙酯標(biāo)準(zhǔn)品適量，用流動(dòng)相溶解配制成100.0μg/mL的對照品貯備液。分別移取不同體積的對照品貯備液于10mL棕色容量瓶中定容，搖勻。按1.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，并測定。記錄色譜流出曲線，以峰面積（A）對濃度C進(jìn)行線性回歸，茜草雙酯在濃度10.0～100.0μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，回歸方程為A=2.76×104C+8.03×103，r=0.9997。

1.5 最低檢測限

按信噪比為3（S/N=3）作為最低檢測限，以濃度為10ng/mL，進(jìn)樣20μL時(shí)，主產(chǎn)物峰信號(hào)約為基線噪音的3倍，即最低檢測限為0.2ng。

1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同批茜草雙酯固體分散體，共6份（約含茜草雙酯5mg），置50mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶液稀釋至刻度，搖勻，再從中移取5mL至10mL棕色容量瓶中定容，搖勻。按1.2項(xiàng)下色譜條件測定，記錄色譜圖。結(jié)果：茜草雙酯平均含量為97.2%，RSD=1.02%（n=6）。

圖1 茜草雙酯及其破壞性實(shí)驗(yàn)的高效液相色譜圖

1.7 溶液的穩(wěn)定性

精密稱取茜草雙酯固體分散體適量（約含茜草雙酯5mg），溶于流動(dòng)相溶液，置50mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶液稀釋至刻度，搖勻，將所得樣品溶液在室溫且避光條件下放置0，1，2，3，4h后分別取樣測定，得主峰峰面積的RSD為0.29%，表明茜草雙酯溶液在4h內(nèi)穩(wěn)定。

2 茜草雙酯固體分散體中有關(guān)物質(zhì)的測定

2.1 茜草雙酯固體分散體的制備

茜草雙酯-PVP固體分散劑，將茜草雙酯與PVP以1∶5的比例溶于適量的無水乙醇，經(jīng)減壓蒸發(fā)除去乙醇，在干燥器內(nèi)平衡數(shù)日，粉碎過八十目篩，得固體分散體樣品[2]，備用。

2.2 試樣溶液的配制

精密稱取不同次制備的茜草雙酯固體分散體各一份（約含茜草雙酯5mg），置50mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶液稀釋至刻度，搖勻。按1.2項(xiàng)下色譜條件測定，記錄色譜圖至主成分保留時(shí)間的2倍，供試品如顯雜質(zhì)峰，按峰面積歸一化法計(jì)算雜質(zhì)含量。結(jié)果如表1。

表1 茜草雙酯固體分散體中有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果

3 討 論

有關(guān)物質(zhì)的檢查是保證藥品安全有效的重要指標(biāo)之一，由于茜草雙酯化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，易發(fā)生氧化和水解等化學(xué)反應(yīng)，其原料藥及制劑的有關(guān)物質(zhì)檢查更不容忽視，因此，必須選擇專屬性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好的方法。茜草雙酯原料藥的有關(guān)物質(zhì)檢測HPLC方法已經(jīng)建立。本研究建立的HPLC方法測定茜草雙酯固體分散體中有關(guān)物質(zhì)的方法表明主峰與各雜質(zhì)峰均能達(dá)到較好分離，具有靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，可用于茜草雙酯固體分散體中有關(guān)物質(zhì)測定。

實(shí)驗(yàn)過程中比較了不同的溶劑，包括：乙醇-水，無水乙醇，甲醇，乙腈及本實(shí)驗(yàn)所用的流動(dòng)相，由于茜草雙酯化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，易氧化和水解及不易溶于水的特點(diǎn)，同時(shí)可以減少溶劑峰對圖譜效果的影響，便于觀察與區(qū)分雜質(zhì)峰，最終確定選擇流動(dòng)相作溶劑，并在實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)注意避光處理，此時(shí)樣品可較好溶解，且在4h內(nèi)穩(wěn)定。

本實(shí)驗(yàn)比較了各種流動(dòng)相對分離效果的影響∶甲醇-水-四氫呋喃=70∶30∶5，甲醇-水-四氫呋喃=70∶20∶5，甲醇-水=80∶20，甲醇：水=70：20，乙腈：水：四氫呋喃=70∶30∶5，乙腈∶水=70∶30，得出當(dāng)流動(dòng)相為乙腈∶水=70∶30時(shí)，茜草雙酯及有關(guān)物質(zhì)的色譜峰峰型、分離度均較好，拖尾因子小，出峰時(shí)間合適。

[1] 王升啟,馬立人.茜草屬藥用植物的化學(xué)成分及生物活性[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊,1991,14(4):254-259.

[2] 肖若蕾,陳莉.茜草雙酯固體分散體的制備及體外溶出實(shí)驗(yàn)[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2009,25(5):457-459.