朱旭江，賀軍權(quán)，杜興，劉霞（1.中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所，蘭州市730000；.甘肅省食品藥品檢驗所，蘭州市 730000；3.中國科學(xué)院研究生院，北京市 100039）

蘭州肉蓯蓉，種名為Cistanche Lanzhouensis Z.Y.Zhang.，生于荒漠草原、半荒漠的山前平原及沙質(zhì)梁地和黃土丘陵、河谷溝等地。蘭州肉蓯蓉寄主單一，目前僅發(fā)現(xiàn)其寄生于植物紅沙Reaumuria soongorica（Pall.）Maxim的根上，常在海拔1 500～2 000m，多在1 600m左右紅沙分布廣的地區(qū)分布。2010年版《中國藥典》（一部）將列當(dāng)科植物肉蓯蓉（C.deserticola Y.C.Ma）和管花肉蓯蓉（C.tubulosa（Schrenk）Wight）共同作為肉蓯蓉的基原植物[1]。肉蓯蓉味甘、咸、微辛酸，性微溫，在《神農(nóng)百草經(jīng)》中列為上品[2]，具有極高的藥用價值，有“沙漠人參”之美譽(yù)，是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，具有滋肝養(yǎng)腎、益精血、潤腸通便之功效[3～9]。肉蓯蓉主要含苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜及其苷類、木脂素苷類、多元醇、多糖等成分[10]，其中苯乙醇苷類物質(zhì)為肉蓯蓉補(bǔ)腎益精的主要有效成分[11，12]，具抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、改善學(xué)習(xí)記憶、免疫調(diào)節(jié)等作用[13]。由于多年的破壞性采挖，野生肉蓯蓉資源已瀕臨枯竭，肉蓯蓉已被列入二級瀕危保護(hù)植物，并收入《國際野生植物保護(hù)名錄》[14～16]。在某些地方，蘭州肉蓯蓉也被當(dāng)作肉蓯蓉入藥[17]，且蘭州肉蓯蓉的多糖含量和正品肉蓯蓉相當(dāng)[18]。目前蘭州肉蓯蓉的特征圖譜研究尚未見報道，因此本試驗采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法建立蘭州肉蓯蓉甲醇提取物的特征圖譜，為建立其穩(wěn)定、可靠、全面的質(zhì)量評價和品種鑒別方法提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

HPLC儀，含1525型輸液泵、2487型紫外檢測器、2996型檢測器、717型自動進(jìn)樣器、Empower色譜軟件（美國Waters公司）；KQ5200型超聲波提取器（昆山市超聲儀器有限公司，頻率：40 kHz，功率：200W）。

肉蓯蓉對照藥材、毛蕊花糖苷對照品、松果菊苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為1101-212300001、1530-200202、11167-200503）；肉蓯蓉 C.deserticola（來源：新疆）、肉蓯蓉C.deserticola（來源：青海）、鹽生肉蓯蓉C.salsa（來源：甘肅酒泉）、蘭州肉蓯蓉C.Lanzhouensis（來源：蘭州市區(qū)及各郊縣，共10批）均由原蘭州市藥品檢驗所專家鑒定為真品，標(biāo)本現(xiàn)存于甘肅省食品藥品檢驗所；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：ZORBAX SB C18（250mm×4.6mm，5μm）；檢測波長：330 nm；流速：1.0m L·m in-1；柱溫：30 ℃；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）。理論板數(shù)以毛蕊花糖苷峰計算應(yīng)不低于2 000。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液 精密稱取毛蕊花糖苷對照品20.12mg，置100m L棕色容量瓶中，作為毛蕊花糖苷對照品貯備液；精密稱取松果菊苷對照品14.00mg，置50m L棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為松果菊苷對照品貯備液。取上述貯備液各5 m L，分別置10m L棕色容量瓶中，分別制成每1m L含毛蕊花糖苷對照品0.1mg和每1m L含松果菊苷對照品0.14mg的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 樣品粉碎后過四號篩，精密稱取粉末1 g，用甲醇超聲提取3次（30、20、20m L），每次15m in，濾過，合并濾液，濃縮至干，用10%乙腈定容至10m L，搖勻，0.45μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 G radientelution

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 參照物試驗 精密吸取毛蕊花糖苷對照品溶液10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，其主峰的保留時間用于確定肉蓯蓉藥材中毛蕊花糖苷的峰位。

2.3.2 進(jìn)樣精密度試驗 取同一份蘭州肉蓯蓉（蘭州市）供試品溶液適量，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10μL，記錄色譜圖。結(jié)果，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD分別＜2%和3%，表明方法精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗 精密稱取蘭州肉蓯蓉藥材（蘭州市）粉末適量，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣10μL進(jìn)行分析。結(jié)果，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均＜3%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取同一份蘭州肉蓯蓉（蘭州市）供試品溶液，分別于0、3、6、12、24、48 h時進(jìn)樣10 μL進(jìn)行分析。結(jié)果，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均＜3%，表明供試品溶液在室溫放置48 h內(nèi)穩(wěn)定。

3 結(jié)果

3.1 樣品的測定

取10批不同產(chǎn)地的蘭州肉蓯蓉藥材粉末各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行測定，并記錄110min內(nèi)的色譜圖。將10批蘭州肉蓯蓉的HPLC特征圖譜，采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版）”軟件計算相似度。指紋圖譜見圖1。

圖1 10批蘭州肉蓯蓉的HPLC指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprints for 10 batchesof C.Lanzhouensis

3.2 特征圖譜共有峰的確定

根據(jù)10批蘭州肉蓯蓉檢測結(jié)果，按照特征圖譜的技術(shù)要求[19]標(biāo)出蘭州肉蓯蓉色譜圖中13個共有峰。各共有峰的保留時間為：峰 1（23.013 m in），峰 2（27.883 m in），峰 3（33.601 m in），峰 4（56.114 m in），峰 5（58.716 m in），峰 6（69.460 min），峰 7（70.081 min），峰 8（84.001 min），峰 9（S，87.918 min），峰 10（92.317min），峰 11（97.262min），峰 12（103.732 min），峰13（105.265min）。蘭州肉蓯蓉HPLC特征圖譜見圖2。

圖2 蘭州肉蓯蓉HPLC特征圖譜Fig 2 HPLC specific chromatogram of C.Lanzhouensis

圖2 中，9號峰為參照物毛蕊花糖苷的色譜峰，9號和10號峰單峰面積占總峰面積的百分比均超過10%，其他峰均未超過5%。故以參照物峰即9號峰的峰面積和相對保留時間為1計算，10號峰的相對保留時間為（1.047±0.003），共有指紋峰的相對峰面積為（7.523±0.066），其余峰僅標(biāo)定相對保留時間，詳見表2。

3.3 相似度分析

指紋圖譜反映的是樣品整體的特征，進(jìn)行指紋圖譜比較可以反映樣品之間的親疏程度，而相似度可以定量地描述指紋圖譜的相似程度。不同產(chǎn)地的蘭州肉蓯蓉指紋圖譜采用“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版）”軟件進(jìn)行分析，該軟件可將多個色譜圖進(jìn)行匯總比較，經(jīng)計算得到可全面反映多個色譜圖特征的對照模式色譜圖，并以此模式為基準(zhǔn)，計算每個色譜圖與之比較的相似度。本試驗采用相關(guān)系數(shù)評價蘭州肉蓯蓉的相似度，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，各樣本之間有很高的相似度，說明采用本法作為蘭州肉蓯蓉藥材鑒定和質(zhì)量評價的依據(jù)是切實可行的。

表2 蘭州肉蓯蓉HPLC指紋圖譜共有峰的相對保留時間Tab 2 Relative retention time of common peaksof HPLC fingerprintsof C.Lanzhouensis

表3 蘭州肉蓯蓉相似度評價結(jié)果Tab 3 Sim ilaritiesof C.Lanzhouensis

3.4 蘭州肉蓯蓉與肉蓯蓉的特征圖譜比較

取肉蓯蓉對照藥材、不同產(chǎn)地的蘭州肉蓯蓉和肉蓯蓉藥材，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液。分別精密吸取上述供試品溶液和毛蕊花糖苷、松果菊苷對照品溶液各10μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)樣測定，并記錄110m in內(nèi)的色譜圖，詳見圖3。

從圖3可知，蘭州肉蓯蓉在肉蓯蓉對照藥材19.65、20.69、28.88、30.108、62.418、64.03、67.24、75.44、79.44、80.33、81.86 min 色譜峰處未見色譜峰，僅在 23.67、27.24、34.08、88.81、97.11m in與對照藥材有共有峰。松果菊苷色譜峰保留時間為67.15min，毛蕊花糖苷色譜峰保留時間為88.62min。

3.5 蘭州肉蓯蓉與肉蓯蓉的相似度評價

以肉蓯蓉對照藥材色譜為對照圖譜，采用國家藥典委員會“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004B版）”軟件進(jìn)行分析。B版須選用對照圖譜，故采用肉蓯蓉對照藥材的色譜為對照圖譜，其他樣品與對照圖譜進(jìn)行相似度分析，結(jié)果見表4。

4 討論

蘭州肉蓯蓉與肉蓯蓉特征圖譜差異較大。其一，色譜峰峰數(shù)有明顯差異：與肉蓯蓉相比，蘭州肉蓯蓉出現(xiàn)許多特征峰的缺失，說明化合物的種類有明顯差異；其二，與肉蓯蓉對照藥材的相似度僅為0.04左右，說明蘭州肉蓯蓉與正品肉蓯蓉存在較大的差異。

松果菊苷和毛蕊花糖苷為肉蓯蓉的主要活性成分，2種成分的色譜峰保留時間分別為67m in和88m in。從結(jié)果分析，肉蓯蓉對照藥材、肉蓯蓉（青海）和肉蓯蓉（新疆）中松果菊苷峰峰形好、峰較高，含量也比較高，但蘭州肉蓯蓉在松果菊苷色譜峰處無色譜峰，說明蘭州肉蓯蓉中未檢測出松果菊苷[20]。蘭州肉蓯蓉中毛蕊花糖苷的色譜峰較高，通過含量計算，蘭州肉蓯蓉（皋蘭縣）中毛蕊花糖苷含量高于肉蓯蓉（青海）和肉蓯蓉（新疆）的含量。

圖3 HPLC特征圖譜A.毛蕊花糖苷對照品；B.松果菊苷對照品；C.肉蓯蓉對照藥材；D.蘭州肉蓯蓉（永登縣）；E.肉蓯蓉（新疆）；F.肉蓯蓉（青海）；G.肉蓯蓉（酒泉市）；H.蘭州肉蓯蓉（蘭州市）Fig 3 HPLC specific chromatogram s A.echinacoside control； B.acteoside control； C.Cistanches Herba reference substance；D.C.Lanzhouensis（Yongdeng）；E.C.deserticola（Xinjiang）；F.C.deserticola（Qinghai）；G.C.salsa（Jiuquan）；H.C.Lanzhouensis（Lanzhou）

表4 肉蓯蓉和蘭州肉蓯蓉相似度評價結(jié)果Tab 4 Sim ilarity evaluation of C.deserticola and C.Lanzhouensis

文獻(xiàn)報道采用乙腈-醋酸系統(tǒng)[21]作為流動相檢測肉蓯蓉藥材，但由于蘭州肉蓯蓉成分復(fù)雜，在文獻(xiàn)方法采用的梯度條件下，存在色譜峰重疊的情況。另外，醋酸體積分?jǐn)?shù)較高，長期使用會影響色譜柱的使用壽命。因此，筆者比較了甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)，最后確定了乙腈-0.1%磷酸水溶液系統(tǒng)作為流動相。經(jīng)試驗采用梯度進(jìn)行洗脫，得到的信息量較豐富，各成分峰形尖銳且分離度良好。采用DAD檢測器進(jìn)行全波長掃描，在210～380 nm區(qū)間選取不同波長，比較蘭州肉蓯蓉在230、280、330、334 nm波長下的HPLC圖譜，結(jié)果在330 nm波長處色譜峰信息最多，且各峰分離良好，故選擇330 nm為檢測波長。試驗中利用DAD檢測器對HPLC圖譜中主要色譜峰進(jìn)行純度檢查，結(jié)果顯示各主要色譜峰純度較好，故本方法除了可以用于定性考察藥材質(zhì)量外，也可用于多種單一成分同時進(jìn)行定量檢測，使測定更加簡便、快捷。

綜上，該方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性較好，可以作為肉蓯蓉質(zhì)量評價和品種鑒別的重要依據(jù)之一。

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