不同因素對(duì)地黃毛蕊花糖苷含量的影響*

任 翔 劉 暢 張梓玉 肖文欣 馬廣堯

(河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046)

地黃(拉丁學(xué)名：Rehmanniaglutinosa)為雙子葉植物綱管狀花目玄參科植物，又名酒壺花、牛奶子、地髓、山菸根等[1]，塊根入藥，是一種重要的傳統(tǒng)藥材，最早著于《神農(nóng)本草經(jīng)》中，為“四大懷藥”之一。不僅在河南、陜西、江蘇等道地產(chǎn)區(qū)有著悠久的栽培歷史，在韓國和日本也有種植。根據(jù)加工炮制方法的不同及藥性的差異可分為鮮地黃、干地黃、熟地黃等種類。地黃在中成藥市場(chǎng)上應(yīng)用普遍，常和其他藥用植物合用制成療效各異的中藥丸劑。地黃含有毛蕊花糖苷、地黃素、環(huán)烯醚萜甙類和糖類等化學(xué)成分。另外，地黃中含有的無機(jī)離子和微量元素主要有鉀、鈣、鈉、鎂等[2]。

毛蕊花糖苷，又稱毛蕊花苷、麥角甾苷、類葉升麻苷等，是一種天然多酚的苯丙氨酸糖苷化合物。毛蕊花糖苷的分子式為C29H36O15，相對(duì)分子質(zhì)量是624.59。純品為白色針晶粉狀，毛蕊花糖苷最早發(fā)現(xiàn)于毛蕊花屬植物，其后在楊丁香花、地腳金、臭梧桐、齊墩果、肉蓯蓉、地黃、毛泡桐、連翹和馬纓丹等200多種不同植物的根、莖、葉和花中均有發(fā)現(xiàn)[2]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)毛蕊花糖苷具有抗氧化、抗腫瘤、抗輻射、神經(jīng)保護(hù)等多種較強(qiáng)的生物活性[3-5]，受到國內(nèi)外相關(guān)研究學(xué)者的廣泛關(guān)注，其藥用價(jià)值和藥理作用的研究近些年來已經(jīng)成為研究開發(fā)天然藥物的新方向[6]。為深入探究地黃中毛蕊花糖苷含量的影響因素，本文從炮制方法、產(chǎn)區(qū)差異、不同部位、采收時(shí)節(jié)入手，為地黃品種培育鑒定和培育毛蕊花糖苷高含量新品種提供理論指導(dǎo)和試驗(yàn)思路。

1 不同炮制方法毛蕊化糖苷含量差異

在地黃進(jìn)行炮制時(shí)，毛蕊花糖苷的糖苷鍵受溫度、輔料等多種因素的影響而發(fā)生部分?jǐn)嗔?、脫去端基單糖等情況，這使熟地黃中毛蕊花糖苷的含量顯著低于生地黃。不同炮制方法對(duì)溫度、輔料的要求有所不同，對(duì)地黃中毛蕊花糖苷的破壞程度也不同。

目前常用的地黃炮制方法有清蒸法、酒燉法和九蒸九曬法，其中清蒸法和酒燉法均未加入辛香類藥物，九蒸九制法中加入了砂仁。比較這3種炮制方法對(duì)地黃中毛蕊花糖苷含量的影響可得出結(jié)論：清蒸熟地黃和酒燉熟地黃中苯丙素苷毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷的含量較生地黃降低;相比生地黃，九蒸九曬制得的熟地黃中異毛蕊花糖苷、苯丙素苷毛蕊花糖苷幾乎完全降解(見表1)。毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷屬于苯丙素苷,均相對(duì)穩(wěn)定,在清蒸熟地黃和酒燉熟地黃中均可以檢測(cè)到,但較生地黃含量下降。而九蒸九曬法中因熟地黃蒸曬次數(shù)較多，毛蕊花糖苷幾乎全部降解[7]。見表1。

表1 不同炮制方法地黃中毛蕊花糖苷含量測(cè)定結(jié)果

2 不同產(chǎn)區(qū)地黃樣品毛蕊花糖苷含量測(cè)定分析

2.1 藥材來源 地黃分別取種植于河南溫縣(海拔110 m)、獲嘉(海拔 90 m)、新鄉(xiāng)市北環(huán) (海拔80 m)、封丘(海拔76 m)和山東單縣(海拔45 m)5個(gè)相近的生態(tài)環(huán)境區(qū)域，烘干粉碎。

2.2 測(cè)定結(jié)果分析 以乙腈-磷酸溶液(體積比1∶1)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長為210 nm，柱溫為23℃;毛蕊花糖苷以乙腈-醋酸溶液(體積比為20∶1)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長為334 nm，柱溫30℃，流量1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL，HPLC分析毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)品和樣品,毛蕊花糖苷含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程:Y=18193X～16.093，R=0.9993，毛蕊花糖苷在0.008 4～0.072 0 μg線性關(guān)系良好。對(duì)不同產(chǎn)區(qū)，同一品種地黃按照上述方法進(jìn)行毛蕊花糖苷含量的測(cè)定，并將測(cè)出值代入回歸方程得出試驗(yàn)結(jié)果。見表2。由表2可知，不同產(chǎn)地地黃樣品中毛蕊花糖苷的含量在0.01%～0.04%波動(dòng)，其中獲嘉產(chǎn)地毛蕊花糖苷含量最高，為0.035%。毛蕊花糖苷含量最低的是新鄉(xiāng)市北環(huán)。通過SPSS分析得出，溫縣、獲嘉差異不顯著，與新鄉(xiāng)市北環(huán)、封丘、單縣有較顯著差異[8]。新鄉(xiāng)市北環(huán)、封丘、單縣3個(gè)地區(qū)毛蕊花糖苷含量偏低可能受自然環(huán)境的水分、光照及人文條件影響。

表2 不同產(chǎn)地地黃樣品中毛蕊花糖苷含量測(cè)定結(jié)果

通過本實(shí)驗(yàn)可以得出，沿河南溫縣向東順黃河經(jīng)獲嘉、新鄉(xiāng)市北環(huán)、封丘直至山東單縣都適宜種植地黃，其中溫縣地區(qū)地黃毛蕊花糖苷含量較其他地區(qū)含量更高且穩(wěn)定，可結(jié)合當(dāng)?shù)厍闆r適當(dāng)調(diào)整為解決市場(chǎng)需求擴(kuò)大地黃種植開辟一條新的途徑[8]。

3 不同部位地黃樣品毛蕊花糖苷含量測(cè)定分析

3.1 毛狀根中毛蕊花糖苷含量測(cè)定條件 稱量1 g原材料粉末在60℃進(jìn)行干燥，然后將其加入100 mL錐形瓶中，再加入70%甲醇溶液10 mL超聲處理45 min，補(bǔ)足質(zhì)量，過濾后將濾液定容至50 mL，搖勻后量取2.5 mL該溶液于50 mL容量瓶中，加入70%的甲醇溶液至刻度處。將溶液搖勻作供試液。毛蕊花糖苷的測(cè)定條件與方法，參照2015年版《中華人民共和國藥典》。毛蕊花糖苷的測(cè)定條件以乙腈-0.1%醋酸溶液(16∶84)為流動(dòng)相；ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250.0 mm，5-Micron)色譜柱，柱溫為30℃；流速為1 mL·min，檢測(cè)波長334 nm[9]。

3.2 毛狀根中毛蕊花糖苷含量的測(cè)定結(jié)果 經(jīng)過實(shí)驗(yàn)得出，在地黃的毛狀根樣品中可以檢測(cè)到少量的毛蕊花糖苷。在地黃誘導(dǎo)后8 d內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組毛狀根中毛蕊花糖苷含量均出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且均在誘導(dǎo)后第2天達(dá)到最高。其中，實(shí)驗(yàn)組毛狀根干重在誘導(dǎo)后的第2天達(dá)到最大值71.48 mg·g-1，約為對(duì)照組毛狀根中毛蕊花糖苷含量(50.72 mg·g-1)的1.41倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但在誘導(dǎo)2 d后，實(shí)驗(yàn)組毛狀根中毛蕊花糖苷的含量相比照組明顯下降的更快，誘導(dǎo)第6天(P<0.01)和第8天(P<0.01)時(shí)顯著低于對(duì)照組中的毛蕊花糖苷含量[10]。

精密稱定地黃葉和地黃樣品粉末各0.1 g，按干燥品計(jì)算，測(cè)得樣本S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10地黃葉中毛蕊花糖苷的含量分別為23.46 mg·g-1、24.94 mg·g-1、27.74 mg·g-1、21.80 mg·g-1、20.45 mg·g-1、15.83 mg·g-1、4.02 mg·g-1、7.71 mg·g-1、9.24 mg·g-1、9.01 mg·g-1。均值為16.12 mg。測(cè)得地黃樣品1、2、3、4、5中的毛蕊花糖苷的含量分別為0.89 mg·g-1、1.13 mg·g-1、1.13 mg·g-1、1.78 mg·g-1、1.98 mg·g-1。均值為1.38 mg·g-1。

經(jīng)對(duì)地黃葉與地黃樣品中毛蕊花糖苷的含量分析發(fā)現(xiàn),相同條件下地黃葉中的毛蕊花糖苷含量均值約為16.12 mg·g-1，而地黃樣品的毛蕊花糖苷含量均值為1.38 mg·g-1，即地黃葉中毛蕊花糖苷的含量高于地黃樣品。進(jìn)而推斷出，毛蕊花糖苷合成主要在地黃葉，其他部位合成較少。

同時(shí)有研究表明[11]，地黃全草和塊根中毛蕊花糖苷含量相差不大，可以推算出塊根不是地黃毛蕊花糖苷的主要合成部位見圖1。

圖1 地黃不同部位毛蕊花糖苷含量隨時(shí)間變化測(cè)定結(jié)果

4 不同時(shí)節(jié)地黃中毛蕊花糖苷的含量

毛蕊花糖苷是地黃眾多化學(xué)成分中較穩(wěn)定的一種。本研究在2015年和2016年分別在道地產(chǎn)區(qū)種植了85-5、北京一號(hào)、沁懷、金九、白選5個(gè)地黃品種。分析了毛蕊花糖苷在不同時(shí)期的地黃塊根和地黃葉片中的含量,為合理種植地黃和選擇毛蕊花糖苷含量較高的新地黃品種提供數(shù)據(jù)依據(jù)和實(shí)驗(yàn)材料。

4.1 道地產(chǎn)區(qū)地黃種植和采收 于2015年和2016年4月中下旬種植。選取地黃塊根直徑2～4cm,分成1.5～2 cm的小段在10年沒有種植且地勢(shì)平坦、沙壤土、肥力好的地塊壟作,雙排種植。每年7月10日、7月30日、8月20日、9月20日、9月30日、10月10日、10月20日、10月30日、11月10日采集地黃塊的根和葉片,從5個(gè)品種中隨機(jī)抽取10株長勢(shì)相當(dāng)?shù)牡攸S植株。將鮮地黃的根、葉洗凈,將根切成約5 mm的小塊，根和葉分別在55℃干燥和粉碎,然后通過藥典3號(hào)篩，粉末放入烘干機(jī)備用[12]。

4.2 不同采收時(shí)期地黃塊根毛蕊花糖苷的含量變化 為分析毛蕊花糖苷在不同品種、不同采收時(shí)期的地黃中的積累規(guī)律,課題組2年內(nèi)檢測(cè)了5個(gè)地黃品種的塊根中毛蕊花糖苷的含量。2015年,5個(gè)品種的毛蕊花糖苷含量在7月至9月相對(duì)較低,10月后較高。85-5、北京一號(hào)、沁懷、金九和白選塊莖中毛蕊花糖苷的含量分別為0.007%～0.253%、0.017%～0.304%、0.008%～0.212%、0.027%～0.461%、0.018%～0.796%。2016年,5種地黃塊莖中毛蕊花糖苷的含量分別為0.017%～0.143%、0.019%～0.132%、0.017%～0.179%、0.023%～0.620%、0.067%～0.403%。在2015年的9個(gè)收獲期中,白選的毛蕊花糖苷含量最高的有6期;2016年,白選毛蕊花糖苷含量最高的有7期,說明白選是5個(gè)地黃品種里毛蕊花糖苷含量較高的。2015年的9期里,沁懷有3期毛蕊花糖苷含量最高,2期第二；2016年,沁懷的毛蕊花糖苷含量2個(gè)時(shí)期第一,5個(gè)時(shí)期第二,說明沁懷的毛蕊花糖苷含量也比較高。另外,其他3個(gè)品種的毛蕊花糖苷含量相對(duì)于白選和沁懷來說較低。

4.3 不同采收期地黃葉片中毛蕊花糖苷含量的變化 分析了除枯葉外5個(gè)品種葉片(整葉)中毛蕊花糖苷的積累規(guī)律。2015年，85-5、北京1號(hào)和金九的葉片毛蕊花糖苷的含量分別為3.043%～5.783%、2.552%～5.941%和2.485%～4.763%，3個(gè)品種的毛蕊花糖苷含量都有3次最高。沁懷和白選的含量較低，分別為1.895%～3.887%和1.717%～5.995%。

2016年北京1號(hào)和金九的含量分別為1.955%～5.968%、0.681%～4.837%和1.950%～5.431%。3個(gè)品種毛蕊花糖苷含量最高的次數(shù)分別是7次，0次、2次。沁懷和白選的毛蕊花糖苷含量分別為1.189%～3.909%和0.693%～4.071%[12]，毛蕊花糖苷含量略低。

4.4 不同發(fā)育階段地黃葉片中毛蕊花糖苷含量的變化 為了分析毛蕊花糖苷的含量在地黃葉片不同生長發(fā)育階段的差異,課題組在2015年和2016年分別檢測(cè)了毛蕊花糖苷在北京1號(hào)和85-5的幼葉、展開葉和衰老葉中的含量。結(jié)果見圖2。幼葉中毛蕊花糖苷的含量是3個(gè)時(shí)期的葉片中最低的。

圖2 不同發(fā)育階段地黃葉片中毛蕊花糖苷含量變化

2015年：北京1號(hào)和85-5葉片在一年的3個(gè)收獲期中毛蕊花糖苷含量變化規(guī)律相同，均為衰老葉>展開葉>幼葉。

2016年：10月20日和10月30日,北京1號(hào)毛蕊花糖苷含量為展開葉>衰老葉>幼葉;11月10日毛蕊花糖苷含量為衰老葉>展開葉>幼葉;在10月20日收獲85-5時(shí),毛蕊花糖苷含量在葉片發(fā)育的3個(gè)時(shí)期差異不明顯。在10月30日和11月10日時(shí),毛蕊花糖苷含量為衰老葉>展開葉>幼嫩葉。2015年和2016年的數(shù)據(jù)顯示,毛蕊花糖苷在衰老葉片和展開葉片中的含量較高。