梁 豪， 李志軍， 張建國， 程遠(yuǎn)合， 孫國賢， 肖 飛， 王曉輝， 王曉彬

癌基因的激活與抑癌基因的失活共同導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。p27是最近幾年發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，國內(nèi)外許多研究發(fā)現(xiàn)其表達(dá)蛋白P27在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)明顯降低或消失，表達(dá)量與腫瘤的病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān)。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種作用強(qiáng)、特異性高的內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原，其通過與內(nèi)皮細(xì)胞膜上的受體結(jié)合而引起一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)新生血管生成，在腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程中同樣發(fā)揮重要作用。本研究擬采用免疫組化SP法檢測(cè)膀胱移行細(xì)胞癌與正常組織中P27、VEGF的表達(dá)情況，探討二者在膀胱移行細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中的作用，為膀胱癌的診斷及臨床治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象及分組 收集2008—2010年河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科手術(shù)切除的60例術(shù)后病理檢查為膀胱移行細(xì)胞癌(bladder transitional cell carcinoma，BTCC)的組織作為BTCC組，其中男38例，女22例，年齡45～75歲，平均年齡58歲。按WHO分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):G1級(jí)24例，G2級(jí)21例，G3級(jí)15例;臨床分期按2002年UICC的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)分為:淺表性癌(Ta～T1)39例，浸潤性癌(T2～T4)21例。同時(shí)選擇10例取自恥骨上經(jīng)膀胱前列腺摘除手術(shù)的正常膀胱組織作為對(duì)照組。BTCC組與對(duì)照組的年齡及性別無顯著差異，具有可比性。

1.2 方法 鼠抗人VEGF單克隆抗體(即用型)，鼠抗人P27單克隆抗體(即用型)及SP試劑盒均購自福建邁新生物技術(shù)開發(fā)公司;免疫組化步驟按過氧化物酶標(biāo)記鏈霉素抗生物素(SP)法進(jìn)行。

1.3 陽性判斷標(biāo)準(zhǔn) 在胞膜和胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)明顯棕黃色顆粒者為VEGF陽性細(xì)胞;在胞核內(nèi)出現(xiàn)明顯棕黃色顆粒者為P27陽性細(xì)胞。以福建邁新生物技術(shù)開發(fā)公司提供的陽性切片作為染色的陽性對(duì)照，切片中陽性細(xì)胞數(shù)≤20%為陰性;陽性細(xì)胞數(shù)＞20%為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

P27在膀胱移行細(xì)胞癌組織中的表達(dá)顯著低于正常膀胱組織，兩者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);VEGF在膀胱移行細(xì)胞癌組織中的表達(dá)顯著高于正常膀胱組織，兩者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);P27在膀胱移行細(xì)胞癌中的陽性表達(dá)率隨腫瘤病理分級(jí)與臨床分期的升高而降低(P＜0.05);VEGF的陽性表達(dá)率則隨腫瘤病理分級(jí)與臨床分期的升高而增高(P ＜0.05)。詳見表1、表2。

表1 P27在膀胱移行細(xì)胞癌組織及正常膀胱組織中的表達(dá)及其與病理分級(jí)、臨床分期的關(guān)系

表2 VEGF在膀胱移行細(xì)胞癌組織及正常膀胱組織中的表達(dá)及其與病理分級(jí)、臨床分期的關(guān)系

3 討論

近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究也有較大進(jìn)展。目前普遍認(rèn)為癌基因的激活、抑癌基因的失活以及兩者的表達(dá)失衡導(dǎo)致了細(xì)胞增殖和凋亡異常，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，無論發(fā)病率還是死亡率均居泌尿系腫瘤的前列［1］。膀胱癌的病理組織學(xué)類型有90%以上是移行細(xì)胞癌，因此有必要對(duì)膀胱移行細(xì)胞癌的生物學(xué)行為進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)即通過對(duì)P27和VEGF在膀胱移行細(xì)胞癌組織中表達(dá)水平的研究，探討其在BTCC發(fā)生和發(fā)展過程中的作用，從而為膀胱移行細(xì)胞癌的診斷及臨床治療提供理論依據(jù)。

3.1 P27與膀胱移行細(xì)胞癌 p27是Polyak等首先發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)控細(xì)胞周期并抑制細(xì)胞分裂的重要基因，他定位于第12號(hào)染色體短臂 1區(qū) 3帶(12p13)，其編碼的P27蛋白含有198個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為27×103，由2個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成。P27蛋白的N端沒有結(jié)構(gòu)鋅指的結(jié)構(gòu)域，C端有2個(gè)分開的核定位信號(hào)。P27主要與cyclin結(jié)合而抑制CDK的激活過程，從而阻止細(xì)胞周期由G1期向S期的轉(zhuǎn)換，進(jìn)而負(fù)性調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制細(xì)胞增殖。P27還可以作為凋亡的啟動(dòng)子誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［2］。一般認(rèn)為，P27表達(dá)的下降可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與已有的相關(guān)報(bào)道結(jié)果基本一致［3-4］，即大多數(shù)正常膀胱組織中P27均高度表達(dá)，而BTCC組織中P27的表達(dá)明顯降低，說明P27可能在BTCC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用;低分化(G3)的腫瘤組織P27的表達(dá)明顯低于高度和中度分化(G1和G2)的腫瘤組織，隨著腫瘤分級(jí)和分期的逐漸增高，P27的表達(dá)逐漸降低，說明P27可能抑制腫瘤的惡性表型，同時(shí)抑制腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移。因此，可以根據(jù)P27的表達(dá)情況初步判斷腫瘤的進(jìn)展及預(yù)后。

3.2 VEGF與膀胱移行細(xì)胞癌 VEGF為血管內(nèi)皮生長因子，是1989年Gosperdarowiz等從牛垂體濾泡星狀細(xì)胞體外培養(yǎng)液中分離出來的一種特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂的因子，是目前知道的唯一能特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成因子，其通過與內(nèi)皮細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，使血漿蛋白外滲，引起繼發(fā)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)新生血管生成。VEGF是腫瘤生成和轉(zhuǎn)移的先決條件之一。目前在許多惡性腫瘤中，如:結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、腎癌等的組織和體外培養(yǎng)的細(xì)胞株中均發(fā)現(xiàn) VEGF mRNA的高表達(dá)［5-6］。但有關(guān)BTCC組織中VEGF表達(dá)的研究國內(nèi)報(bào)道很少。

膀胱移行細(xì)胞癌是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，BTCC瘤體的生長亦依賴于新血管的生成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常膀胱組織中VEGF的表達(dá)很低(陽性率10%)，而BTCC組織中的表達(dá)則明顯升高;隨著腫瘤分級(jí)和分期的逐漸增高，VEGF的表達(dá)逐漸上升。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與 Salven等［7］及 Jacobsen等［8］的報(bào)道結(jié)果一致。通過對(duì)BTCC細(xì)胞中VEGF表達(dá)的研究，不難推測(cè)VEGF在BTCC的發(fā)生發(fā)展中起促進(jìn)作用;且VEGF的表達(dá)隨著腫瘤病理分級(jí)和臨床分期的升高而升高，因此其可作為觀察BTCC的進(jìn)展情況和判斷臨床預(yù)后的指標(biāo)。

總之，膀胱移行細(xì)胞癌組織中P27表達(dá)水平的明顯下調(diào)以及VEGF表達(dá)水平的明顯上調(diào)，可能與膀胱移行細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移有關(guān)，檢測(cè)二者的表達(dá)有助于綜合判斷BTCC的生物學(xué)行為。

［1］ Parkin DM，Bray F，F(xiàn)erlay J，et al.Global Cancer Statistics，2002［J］.CA Cancer J Clin，2005，55(2):74-108.

［2］ 宋成，楊惠玲.細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子P27與腫瘤［J］.中國病理生理雜志，2004，20(6):1116-1120.

［3］ 廖義翔，楊為民，葉章群.Cyclin D1、p27、ki-67在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)及其意義［J］.臨床外科雜志，2006，14(11):713-715.

［4］ 管建云，魏林生，趙高賢，等.PTEN和P27在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2007，17(19):1118-1120.

［5］ Appelmann I，Liersch R，Kessler T，et al.Angiogenesis inhibition in cancer therapy:platelet-derived growth factor(PDGF)and vascular endothelial growth factor(VEGF)and their receptors:biological functions and role in malignancy［J］.Recent Results Cancer Res，2010，180:51-81.

［6］ 吳飛翔，曹 驥，趙蔭農(nóng)，等.肝細(xì)胞癌組織中VEGF、MMP-2和MVD的表達(dá)及其相關(guān)性研究［J］.腫瘤學(xué)雜志，2007，13(6):474-476.

［7］ Salven P，MnpH，Orpana A，et al.Serum vascular endothelial growth factor is often elevated in disseminated cancer［J］.Clin Cancer Res，1997，3(5):647-651.

［8］ Jacobsen J，Rasmuson T，Grankvist K，et al.Vascular endothelial growth factor as prognostic factor in renal cell carcinoma［J］.J Urol，2000，163(1):343-347.