董劍輝,熊惠軍,宋 立,陳 瑞

(1.華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院,廣東 廣州 510642;2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 海淀 100081)

喹諾酮類藥物是獸醫(yī)臨床治療動物細菌性疾病一類常用抗菌藥物,此類藥物的廣泛應用,使動物源大腸桿菌對其耐藥性也隨之逐漸上升[1]。細菌對喹諾酮類藥物的耐藥機制主要是染色體介導的靶位改變、膜通透性改變和主動外排。近年來,質粒介導的喹諾酮類藥物耐藥(plasmid mediated quinolone resistance,PMQR)基因 qnrA[2],qnrB[3]、qnrS[4]相繼出現(xiàn),aac(6′)-Ib-cr和qep A這兩種質粒介導的耐藥基因也被證實[5-6]。本試驗通過微量肉湯稀釋法,檢測2009年雞源大腸桿菌的耐藥情況,選擇耐喹諾酮類藥物的菌株,采用PCR方法檢測PMQR基因,以了解不同地區(qū)雞源大腸桿菌中PMQR基因的流行情況。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2009年從福建、廣西、天津等地的蛋雞場,采泄殖腔拭子,用麥康凱培養(yǎng)基分離、API 20E試條鑒定,分別分離到大腸桿菌 76、44、62株,共計182株。

1.2 主要試劑 麥康凱培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、MH肉湯由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所基礎保障室提供;抗菌藥藥敏板購自天津金章科技發(fā)展有限公司;API 20E試條購自BioMerieux公司;DNA Marker DL-2000購自 TaKa Ra公司;BtsCI購自NEB公司;Go Taq G reen Master Mix購自Promega公司;大腸桿菌質控菌株ATCC25922由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.3 耐藥性測定 用藥敏板進行檢測,試驗方法和判斷標準參考臨床與試驗標準協(xié)會(CLSI)所推薦的微量肉湯稀釋法。

1.4 引物的設計與合成 根據Gen Bank已知的序列,用Premier 5.0分別設計出5個基因的特異性引物(見表1),由Invitrogen公司合成。

表1 PC R引物序列

1.5 PCR擴增 用煮沸法提取DNA模板。根據不同的反應條件 PCR擴增 qnrA、qnrB、qnrS、aac(6′)-Ib和qep A 基因,對于aac(6′)-Ib的陽性株,膠回收后用BtsCI酶切,aac(6′)-Ib能被酶切,而 aac(6′)-Ib-cr不能被酶切。擴增陽性產物均送 Invitrogen公司測序,驗證質粒序列。

2 結果與分析

2.1 藥敏試驗結果 182株雞源大腸桿菌對13種抗菌藥物的耐藥率排序如下:四環(huán)素(96.15%)、磺胺異噁唑(92.86%)、復方新諾明(86.26%)、氨芐西林(80.77%)、氟苯尼考(78.02%)、阿莫西林/克拉維酸(73.08%)、恩諾沙星(74.73%)、氧氟沙星(65.93%)、慶大霉素(45.60%)、頭孢噻呋(33.52%)、頭孢唑林(28.02%)、阿米卡星(15.93%)、多粘菌素E(9.89%)。

2.2 PMQR基因檢測結果 挑取耐恩諾沙星或氧氟沙星的菌株共166株,除qnrB外,PCR對其余四種質粒均有檢出(見表2)。部分陽性株電泳結果見圖1。

表2 不同地區(qū)大腸桿菌PMQR基因陽性率

圖1 陽性PCR產物電泳圖

3 討論

喹諾酮類藥物在獸醫(yī)臨床上的大量使用,導致了大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥率的上升。從試驗結果可以看出,2009年部分地區(qū)的雞源大腸桿菌,對獸醫(yī)臨床常用抗菌藥存在耐藥現(xiàn)象,對四環(huán)素、磺胺異噁唑、復方新諾明、氨芐西林、氟苯尼考、阿莫西林/克拉維酸、恩諾沙星、氧氟沙星等的耐藥率均大于65%,這可能與這類藥物的廣泛使用有關;而對阿米卡星、多粘菌素的耐藥率均小于20%,不同藥物的耐藥率差別較大,這可能與使用的藥物不同有關。

目前,PMQR基因的廣泛存在已經在世界范圍內得到證實[7],各種基因的陽性率從1%～36%不等[4,8-9]。本研究對166株耐喹諾酮藥物的雞源大腸桿菌進行PMQR基因的檢測,共檢測到1株qnrA陽性菌株,16株qnrS陽性菌株,26株aac(6′)-Ib-cr陽性菌株和4株qepA陽性菌株,其陽性率分別為0.60%、9.64%、15.66%、2.41%,以 qnrS 和 aac(6′)-Ib-cr這兩種基因為主。從不同地區(qū)PMQ R基因的檢測結果來看,qnrA和qepA分別只在福建和廣西的分離株中檢出;對于qnrS基因,在天津的48株大腸桿菌中,陽性率為 20.83%,遠高于福建(5.41%)和廣西(4.55%)兩個地區(qū) ;而 aac(6′)-Ibcr基因在福建(22.97%)和天津(14.58%)的分離株中,陽性率也較高。由此可見,PMQR基因陽性的檢出率可能與分離株的地域性有一定的關系。另外,由于菌株采集的數(shù)量以及不同養(yǎng)殖場用藥情況的不同,也可能造成PMQR基因檢出率的差異。

由于PMQR基因可在不同微生物間進行水平傳播,將會加快喹諾酮類藥物耐藥性在細菌間的傳播,從而導致大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥性進一步增強。因此,有必要在國內進行全面的喹諾酮類藥物耐藥性機理研究和PMQR基因的檢測,建立相關數(shù)據庫,以指導合理使用喹諾酮類藥物,從而減少喹諾酮類藥物耐藥菌的產生和耐藥質粒的傳播。

[1]Yang H C,Ch en S,White D G,et a l.Characterization of m ultiple-antimicrobial-resistant E scherich ia coli isolates from diseased chickens and sw ine in China[J].Jou rn al of clinical m icrobiology,2004,42(8):3483-3489.

[2]Martinez-Martinez L,Pascual A,Jacoby G A.Quinolone resistan ce from a transferable plasmid[J].Lancet,1998,351(9105):797-799.

[3]Jacoby G A,Walsh K E,Mills D M,et a l.QnrB,another plasmid-mediated gene for quinolone resistance[J].An timicrob Agents Chemother,2006,50(4):1178-1182.

[4]Hata M,Suzuki M,Matsu moto M,eta l.C loning of a novel gene for qunoloine resistance from a transferab le plasmid in S higella flexneri 2b[J].An timicrob Agents Chemother,2005,49(2):801-803.

[5]Park C H,Robicsek A,Jacoby G A,eta l.Prevalence in the United States of aac(6′)-Ib-cr encoding a ciprofloxacin-modifying enzyme[J].Antimicrob Agents Chem oth er,2006,50(11):3953-3955.

[6]Yam ane K,Wachino J,Suzuki S,et al.New plasmid-mediated fluoroquin olone efflux pu mp,QepA,found in an Escherichia coli clinical isolates[J].Antimicrob Agents Chem other,2007,51(9):3354-3360.

[7]Ode T,S aito R,Kumita W,etal.An aly sis of plasmid-mediated multid ru g resistan ce in Escherich ia co li and K leb siella oxytoca isolates from clinicalspecim ens in Japan[J].In ternational Journal of Antimicrobial Agents,2009,34(4):347-350.

[8]Yue L,Jiang H X,Liao X P,etal.Prevalence of plasmid-mediated quinolone resistance qnr genes in poultry and sw ine clinical isolates of Escherichia co li[J].Veterinary Microbiology,2008,132(3-4):414-420.

[9]Baud ry P J,Nichol K,DeCorby M,et al.Mechanism s of resistan ce and mobility among multid ru g-resistant C TX-M-producing Escherichia coli from Canadian in tensive care u nits:the 1 st report of QepA in North America[J].Diagnostic Microbiology and Infectiou s Disease,2009,63(3):319-326.