李 軍，彭 昊，陶 立，朱娟娟，陳澤祥，韋志鋒，蘭美益，秦若甫，楊 威

（1.廣西獸醫(yī)研究所，廣西 南寧 530001；2.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005）

山羊大腸桿菌病是一種嚴(yán)重危害廣西山羊養(yǎng)殖的細(xì)菌性疾病，該病多發(fā)于數(shù)日齡至6周齡的羔羊，主要經(jīng)消化道感染，引起羔羊腹瀉、脫水和毒血癥死亡；此外，大腸桿菌還可侵入腸壁進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)發(fā)展成為敗血型大腸桿菌病。大腸桿菌種類眾多，在大腸桿菌流行病學(xué)調(diào)查和病原性研究中，人們引入分型方法對(duì)其進(jìn)行研究。傳統(tǒng)的大腸桿菌分型方法是以大腸桿菌抗原O、K、H的抗原性為基礎(chǔ)，通過血清學(xué)方法進(jìn)行分型［1-2］。由于大腸桿菌O、K、H抗原的氨基酸同源性較高，彼此間存在抗原交叉，應(yīng)用血清學(xué)方法難以準(zhǔn)確區(qū)分，給大腸桿菌的鑒定造成了困難［3］。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，以基因?yàn)榛A(chǔ)的分子分型方法憑著準(zhǔn)確、敏感和分辨性高的優(yōu)點(diǎn)克服了傳統(tǒng)血清學(xué)分型的局限。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性方法（randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）是在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展的一項(xiàng)基因分型技術(shù)，因其成本低、操作簡(jiǎn)捷、無需預(yù)先了解基因序列等優(yōu)點(diǎn)，在生物物種全基因DNA的多態(tài)性檢測(cè)分析中得到廣泛應(yīng)用［5-7］。本實(shí)驗(yàn)室在開展廣西山羊細(xì)菌性疾病流行病學(xué)調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)血清學(xué)分型方法無法準(zhǔn)確對(duì)臨床分離的大腸桿菌進(jìn)行分型，因此，本試驗(yàn)旨在應(yīng)用RAPD技術(shù)對(duì)廣西山羊大腸桿菌進(jìn)行分子分型，為其流行病學(xué)研究提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。PCR Taq Mix、DNA Marker 3，購(gòu)自廣東東盛生物科技有限公司；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，購(gòu)自北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司。PCR儀，購(gòu)自日本TaKaRa公司；凝膠成像系統(tǒng)，購(gòu)自美國(guó)Alpha Inotech公司。

1.2 菌株來源 10株大腸桿菌分離自山羊組織和糞便，由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存（表1）。

1.3 引物 根據(jù)文獻(xiàn)［7-9］報(bào)道的相關(guān)序列設(shè)計(jì)8條隨機(jī)引物，引物P1序列為：5′-ACTTGACGGG-3′，P2：5′-GAGCCCTCCA-3′，P3：5′-TGCCCGTCGT-3′，P4：5′-CAGCTCACGA-3′，P5：5′-AGC GTC CTC C-3′，P6：5′-GGCTCATGTC-3′，P7：5′-GTGCAATGAG-3′，P8：5′-AAGAGCCCGT-3′。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。菌株Sn11和Nx31、菌株Nx32和Nx34的遺傳關(guān)系最密切；菌株Ms03的遺傳關(guān)系與其余9株菌株最遠(yuǎn)。

表1 本試驗(yàn)所用大腸桿菌菌株

1.4 模板DNA的提取 挑取單個(gè)菌落于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)18h，生理鹽水洗脫細(xì)菌，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒抽提細(xì)菌DNA，提取方法按說明書進(jìn)行。

1.5 RAPD擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系為25μL，其中PCR Taq Mix 12μL、引物（25pmol／μL）1μL、DNA模板2.5μL、ddH2O 9.5μL。反應(yīng)條件為：95℃ 預(yù)變性5min；隨后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃1min，36℃1min，72℃2min，最后72℃延伸10min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10μL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察。

1.6 聚類分析 對(duì)每株細(xì)菌的RAPD多態(tài)性電泳圖譜進(jìn)行分析，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，在SPSS軟件中，采用組間均聯(lián)法進(jìn)行聚類分析，作出聚類分析樹狀圖。

2 結(jié)果

在選用的8條引物，引物P3、P4、P5和P8表現(xiàn)出較好的多態(tài)性擴(kuò)增（圖1），共擴(kuò)增出18條DNA片段，10株菌株無共有條帶。

對(duì)每株細(xì)菌的RAPD多態(tài)性電泳圖譜進(jìn)行擴(kuò)增條帶的統(tǒng)計(jì)，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，在SPSS軟件中，采用組間均聯(lián)法進(jìn)行聚類分析，作出聚類分析樹狀圖（圖2）。在聚類圖中，菌株Sn11和Nx31、菌株Nx32和Nx34的遺傳關(guān)系最密切；菌株Ms03的遺傳關(guān)系與其余9株菌株最遠(yuǎn)。

3 討論

圖1 引物P3（A）、P4（B）、P5（C）、P8（D）對(duì)10株大腸桿菌的隨機(jī)擴(kuò)增圖譜

圖2 根據(jù)RAPD結(jié)果繪制的聚類圖

傳統(tǒng)的大腸桿菌分型方法屬血清學(xué)分型。在許多情況下，這些傳統(tǒng)的分型方法局限性大［3］，存在難以區(qū)分變異株及稀有血清型等問題。而RAPD可以對(duì)未知序列基因組進(jìn)行多態(tài)性分析，比傳統(tǒng)分型方法更能反映病原菌菌株間的親緣關(guān)系，能從分子水平上揭示了不同菌株之間的遺傳距離［4］。樣品DNA經(jīng)隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增后得到的相同帶譜的數(shù)目與樣品間的遺傳關(guān)系呈正相關(guān)［5］，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物物種的分型鑒定。本試驗(yàn)應(yīng)用RAPD技術(shù)對(duì)在山羊致病性大腸桿菌病流行病學(xué)調(diào)查所分離的10株大腸桿菌進(jìn)行了基因分型，可為分子流行病學(xué)調(diào)查提供有效的手段。

本試驗(yàn)采用8條引物對(duì)10株分離自山羊的致病性大腸桿菌進(jìn)行RAPD分析，有4條引物獲得了良好的擴(kuò)增，共擴(kuò)增出18條不同的DNA片段。RAPD圖譜表明，分析的山羊致病性大腸桿菌存在基因多態(tài)性，菌株Sn11與Nx31、菌株Nx32與Nx34的RAPD圖譜相同，且聚類分析歸為一類，表明菌株Sn11與Nx31，菌株Nx32與Nx34的遺傳關(guān)系密切，這與菌株的血清凝集反應(yīng)結(jié)果是吻合的。菌株Nx32與Nx34都是從同一樣本中分離得到，因此這兩株菌有可能是同一菌株的兩次分離。菌株Nx31、Nx32與Nx34都是從同一樣本中分離得到，且菌株Nx31與Nx32的血清凝集反應(yīng)結(jié)果相同，曾被認(rèn)為是同一菌株的兩次分離，但是在RAPD分析中，兩株細(xì)菌的帶譜還是存在明顯差別，說明菌株Nx31與Nx32只是遺傳關(guān)系較為密切的兩株細(xì)菌，這一結(jié)果也說明RAPD比血清學(xué)分型具有更高的分辨性，可以作為動(dòng)物疫病流行病學(xué)調(diào)查和細(xì)菌鑒定的一種實(shí)用技術(shù)。

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