J亞群禽白血病病毒gp85單抗1E3株抗原識別表位的初步分析

莫虹斐，余 多，孫 淼，陳福勇，曹 紅

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

J亞型禽白血病是由J亞群禽白血病病毒（ALV-J）引起的一種以成髓細(xì)胞增生、免疫抑制、生長發(fā)育受阻為特點(diǎn)的傳染性腫瘤疾?。?-2］，于1988年由英國的Payne博士［3］等首次發(fā)現(xiàn)。該病近年來在我國的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。ALV-J基因組主要含有3個(gè)基因，即gag、pol和env，其中env基因編碼的囊膜表面蛋白gp85是病毒抗原的主要成分，決定病毒亞群特異性和宿主范圍［4］。2000年，秦愛建、崔治中等［5］首次在國內(nèi)研制了抗J亞群禽白血病病毒囊膜糖蛋白特異性單克隆抗體，并分析了其識別的ALV-J囊膜糖蛋白的分子量為90～94kD，識別的未糖基化的囊膜蛋白分子量約為53kD；2003年，楊玉瑩、秦愛建等［6］首次克隆表達(dá)了gp85基因，證明gp85蛋白具有病毒的抗原特異性。但目前國內(nèi)外尚無ALV-J gp85單克隆抗體識別的具體表位的相關(guān)報(bào)道。

本試驗(yàn)為了初步確定ALV-J gp85單克隆抗體1E3株所識別的抗原位點(diǎn)，將S1株的gp85基因進(jìn)行了分段克隆表達(dá)，并通過免疫印跡的方法進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1E3株單抗識別的抗原表位位于gp85蛋白N端第69至112個(gè)氨基酸之間。此項(xiàng)研究為進(jìn)一步分析ALV-J中國分離株S1的抗原性變異及gp85蛋白的抗原表位所在位點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)，為建立以表位為基礎(chǔ)的抗原抗體診斷方法提供了必要的物質(zhì)材料支持，對于深入了解ALV-J的亞群特性、致病機(jī)理以及診斷和預(yù)防均具有重要的理論和實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 菌種與質(zhì)粒 感受態(tài)細(xì)胞DH5α及BL21購于北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司，原核細(xì)胞表達(dá)載體pGEX-6p-1、重組質(zhì)粒pET-28a-J gp85，均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑及試劑盒 ALV-J S1gp85特異性單克隆抗體1E3株，為本實(shí)驗(yàn)室制備；限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ、XhoⅠ、10×K Buffer，購自 TaKaRa公司；Taq plus DNA聚合酶、10×PCR Buffer、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；dNTPs、IPTG，購自北京盛旭百川生物科技有限公司；抗GST標(biāo)簽小鼠單克隆抗體、高靈敏化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；高純度質(zhì)粒小量提取試劑盒，購自北京威格拉斯生物技術(shù)有限公司；DNA純化與濃縮-25試劑盒、凝膠DNA回收試劑盒，均購自Zymo Research公司。

1.3 基因片段的初次分段亞克隆 對重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-J gp85進(jìn)行測序及同源性分析，根據(jù)ALV-J S1株病毒gp85基因序列，設(shè)計(jì)兩對特異性引物A和B，用于擴(kuò)增gp85基因A片段（1～687 bp）和B片段（337～921bp），在上、下游引物中分別引入酶切位點(diǎn)Bam HⅠ和XhoⅠ（下劃線），同時(shí)還加入保護(hù)性堿基和終止密碼子。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%DNA瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.4 重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-1-J gp85-A、pGEX-6p-1-J gp85-B的構(gòu)建 PCR產(chǎn)物經(jīng)過回收和純化，用限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，同時(shí)表達(dá)載體也進(jìn)行雙酶切。將目的基因和載體用SolutionⅠ酶連接，構(gòu)建成重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α并進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落并提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定，將雙陽性質(zhì)粒送檢測序。陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞BL21，構(gòu)建基因重組表達(dá)工程菌。

1.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和Western-blot鑒定37℃振搖培養(yǎng)工程菌，至OD600＝0.4～0.6時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h，重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳1h，產(chǎn)物經(jīng)4℃、100V、200mA恒流轉(zhuǎn)印1h至PVDF膜上，5%脫脂乳4℃封閉8h，經(jīng)PBST洗滌3次后，分別以抗GST標(biāo)簽鼠單克隆抗體和ALV-J gp85單抗1E3株為一抗，室溫下孵育1h，PBST洗滌6次。以HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，室溫下孵育30min，PBST洗滌6次。最后滴加適量發(fā)光液，曝光1～10min，標(biāo)記并保存膠片。

1.6 基因片段A的分段亞克隆、表達(dá)及鑒定 根據(jù)其片段A的基因序列，設(shè)計(jì)兩對特異性引物，分別用于C片段（1～204bp）和D片段（115～336bp）的擴(kuò)增和克隆。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%DNA瓊脂糖凝膠電泳分析。

PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、連接后構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-1-J gp85-C、pGEX-6p-1-J gp85-D。鑒定后，按照前述方法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和Western-blot鑒定（轉(zhuǎn)印40min、曝光1～3min）。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)室保存的ALV-J S1株gp85基因核苷酸長度為921bp，編碼307個(gè)氨基酸。經(jīng)測序比對，與已發(fā)表的NX0101株的gp85基因核苷酸序列同源性為96%，發(fā)生了22個(gè)氨基酸點(diǎn)突變，在118處缺失一個(gè)組氨酸（H）。

2.2 ALV-J gp85-A、ALV-J gp85-B重組質(zhì)粒的構(gòu)建 通過PCR技術(shù)亞克隆了gp85-A和gp85-B基因片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，與預(yù)期大小相符（圖1）。

2.3 重組蛋白gp85-A、gp85-B的SDS-PAGE分析 預(yù)期重組蛋白gp85-A大小為51kD，gp85-B為48kD。經(jīng)SDS-PAGE結(jié)果表明，重組菌誘導(dǎo)后在45kD處出現(xiàn)一條較粗的蛋白條帶，大小與目的蛋白的理論值相符，初步確定為重組蛋白?？蛰d體誘導(dǎo)后在約25kD處出現(xiàn)一條較粗的蛋白條帶，初步確定為GST標(biāo)簽蛋白。而空載體、重組菌的不誘導(dǎo)對照組的相應(yīng)位置處均無相應(yīng)條帶（圖2）。

2.4 重組蛋白gp85-A、gp85-B的Western-blot分析 重組蛋白與抗GST標(biāo)簽鼠單克隆抗體反應(yīng)的Western-blot結(jié)果可見，重組蛋白在蛋白質(zhì)Marker的50kD處出現(xiàn)特異帶，空載體標(biāo)簽蛋白在大約26 kD處出現(xiàn)條帶（圖3）。

圖3 重組蛋白的Western-blot分析

重組蛋白與ALV-J S1gp85特異性單抗1E3株反應(yīng)的Western-blot結(jié)果可見，gp85-A蛋白出現(xiàn)特異帶，而gp85-B、空載體標(biāo)簽蛋白沒有出現(xiàn)任何條帶（圖4）。證明僅有g(shù)p85-A蛋白可以被ALV-J S1gp85特異性單抗1E3株所識別。

圖4 重組蛋白與gp85單抗1E3株的Western-blot分析

2.5 ALV-J gp85-C、ALV-J gp85-D重組質(zhì)粒的構(gòu)建 通過PCR技術(shù)亞克隆了gp85-C和gp85-D基因片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，與預(yù)期大小相符（圖5）。

圖5 基因片段gp85-C、gp85-D的PCR產(chǎn)物電泳圖

2.6 重組蛋白gp85-C、gp85-D的SDS-PAGE分析 預(yù)期重組蛋白gp85-C大小為33kD，gp85-D為34kD。經(jīng)SDS-PAGE結(jié)果表明，重組菌誘導(dǎo)后在25～35kD之間有一條較粗的蛋白條帶，大小與目的蛋白的理論值相符，初步確定為重組蛋白?？蛰d體誘導(dǎo)后在約25kD處出現(xiàn)一條較粗的蛋白條帶，初步確定為GST標(biāo)簽蛋白。而空載體、重組菌的對照組（不誘導(dǎo)）的相應(yīng)位置處均無相應(yīng)條帶（圖6）。

2.7 重組蛋白gp85-C、gp85-D的 Western-blot分析 重組蛋白與抗GST標(biāo)簽鼠單克隆抗體反應(yīng)的Western-blot結(jié)果可見，重組蛋白在大約蛋白質(zhì)Marker的35kD處出現(xiàn)特異帶，空載體標(biāo)簽蛋白在大約26kD處出現(xiàn)條帶（圖7）。

重組蛋白與ALV-J S1gp85特異性單抗1E3株反應(yīng)的Western-blot結(jié)果可見，gp85-D蛋白出現(xiàn)特異帶，而gp85-C沒有出現(xiàn)任何條帶（圖8）。證明僅有g(shù)p85-D蛋白可以被ALV-J S1gp85特異性單抗1E3株所識別。

圖8 重組蛋白與gp85單抗1E3株的Western-blot分析

2.8 抗原表位初步分析 為了初步確定ALV-J gp85單抗1E3株所識別的抗原位點(diǎn)，我們用ALV-J S1gp85單克隆抗體1E3株對重組表達(dá)蛋白進(jìn)行Westem-blot分析。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，初次亞克隆中，僅gp85-A蛋白被單抗識別，反應(yīng)出現(xiàn)了特異條帶，而gp85-B蛋白則沒有，結(jié)合兩者的氨基酸序列，gp85-A蛋白包含了第1～229個(gè)氨基酸，gp85-B蛋白包含了第112～307個(gè)氨基酸，說明該株gp85單抗的抗原表位可能在第1～112個(gè)氨基酸之間，對應(yīng)的核苷酸序列為1～336bp。再次亞克隆時(shí)，針對gp85基因的1～336bp核苷酸序列進(jìn)行分段，試驗(yàn)結(jié)果表明，gp85-C未出現(xiàn)任何條帶，而gp85-D則被單抗識別，出現(xiàn)了特異條帶，結(jié)合兩者的氨基酸序列，gp85-C蛋白包含了第1～68個(gè)氨基酸，gp85-D蛋白包含了第38～112個(gè)氨基酸，因此，最終結(jié)果表明，ALV-J S1gp85單抗1E3株的抗原表位可能在第69到112個(gè)氨基酸（N端）之間，對應(yīng)的核苷酸序列為205～336bp。

3 討論

3.1 ALV-J表型的決定因素是位于病毒表面，與宿主細(xì)胞受體作用的囊膜蛋白gp85，本試驗(yàn)利用國內(nèi)分離的ALV毒株，采用PCR技術(shù)成功分段擴(kuò)增了ALV-J的gp85基因，利用pGEX-6p-1載體在BL21中成功表達(dá)了該基因，SDS-PAGE及 Western-blot結(jié)果表明，表達(dá)的目的蛋白大小與預(yù)期相符，具有反應(yīng)原性。重組蛋白gp85-A、gp85-D經(jīng)Western-blot檢測表明，具有g(shù)p85單抗1E3株可識別的抗原表位。本試驗(yàn)初步研究了ALV-J囊膜蛋白gp85的抗原決定簇，為進(jìn)一步研究中國株ALVJ gp85的抗原性變異及gp85蛋白的抗原表位所在位點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)，并為進(jìn)一步研制針對 ALV-J gp85蛋白的快速檢測試劑盒提供了有力的工具。

3.2 本試驗(yàn)是為了分析gp85蛋白單抗識別的抗原表位，這就需要重組蛋白具有較大的表達(dá)量，而非易于提純的特點(diǎn)。pGEX載體表現(xiàn)氨芐青霉素抗性，其特點(diǎn)是在載體上接上了一種26kD的谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶基因，這使得表達(dá)后的融合蛋白上含有1個(gè)26kD的GST標(biāo)簽蛋白［7］，可增大重組蛋白的質(zhì)量，易于在電泳時(shí)觀察和分析結(jié)果。

3.3 決定抗原表位的3個(gè)主要因素即親水性、抗原指數(shù)和表面可能性，由ALV-J S1分離株gp85蛋白的氨基酸序列的抗原表位預(yù)測結(jié)果表明，可能存在著6個(gè)極有可能構(gòu)成抗原表位的區(qū)域，其位置分別在第80～90個(gè)、第90～100個(gè)、第110～120個(gè)、第140～150個(gè)、第180～200個(gè)、第300～307個(gè)氨基酸之間。本試驗(yàn)的結(jié)果符合以上預(yù)測。

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