王春花,付云威,張秀英
(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030;2.黑龍江農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)職業(yè)學(xué)院制藥工程系,黑龍江 牡丹江 157000;3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150030)
中藥大黃(Rheum tanguticum Maxim.)為蓼科植物的根莖,成分豐富,20世紀(jì)大黃的研究主要集中于蒽類,近年研究發(fā)現(xiàn),曾被忽視的成分大黃多糖(rheum tanguticum polysaccharide,RTP)具有廣泛的生物活性,大黃多糖具有降血糖、治療結(jié)腸炎、腦保護(hù)、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力及降低細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的作用。但大黃多糖提取優(yōu)化工藝的試驗報道少,超聲波提取工藝的試驗仍為空白,并且其抗病毒活性研究報道也甚少。新城疫是對養(yǎng)雞業(yè)危害較嚴(yán)重的傳染病之一,給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,而目前能有效低毒的防治新城疫病毒性疾病的藥物缺乏。本試驗以大黃多糖為研究對象,對大黃多糖超聲波法提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,并對純化后大黃多糖的抗新城疫病毒活性進(jìn)行觀察試驗,確定了大黃多糖最佳提取工藝,為防治新城疫病毒性疾病提供科學(xué)依據(jù),報告如下。
1.1 試劑與病毒 唐古特大黃購于哈爾濱世一堂藥店;病毒唑購于東北制藥總廠;所用試劑均為國產(chǎn)分析純;F9E48新城疫病毒由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所禽病實(shí)驗室提供;9周齡SPF雞胚由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗動物中心提供。
1.2 多糖含量測定方法[1]采用苯酚-硫酸法對多糖含量進(jìn)行測定,多糖提取率及含量的換算公式如下:
多糖占粗提物的比率(多糖提取率)=糖重量(經(jīng)OD值換算)/多糖測樣質(zhì)量×100%
中藥中多糖含量(多糖含量)=多糖提取率×提取粗多糖重量/中藥總重量×100%
1.3 傳統(tǒng)法提取大黃多糖 準(zhǔn)確稱取5g大黃(大黃提取前需經(jīng)干燥粉碎,回流提取,過濾干燥處理),分3次加蒸餾水達(dá)樣品量的20倍、10倍、10倍,各蒸煮1h,合并提取液過濾、濃縮和醇沉,干燥得大黃多糖,稱重,計算多糖提取率和多糖含量。
1.4 大黃多糖超聲波法提取工藝的優(yōu)化 以提取時間、溫度、料液比、pH 值為單因素考察對象(表1),以多糖含量及多糖提取率為多糖提取效果指標(biāo),優(yōu)化超聲波法提取大黃多糖的單因素參數(shù)。采用正交試驗法優(yōu)化提取工藝(表2)。將最優(yōu)提取參數(shù)下大黃多糖提取與傳統(tǒng)提取方法比較。
表1 單因素考察
表2 正交設(shè)計試驗因素水平
1.5 大黃多糖抗新城疫病毒活性檢測 本試驗選擇體外跟蹤法,以雞胚成纖維細(xì)胞為平臺對大黃多糖抗新城疫病毒進(jìn)行研究,細(xì)胞培養(yǎng)方法參照殷震[2],接種倍比稀釋NDV病毒液,培養(yǎng),觀察記錄,根據(jù)Reed-Muench公式計算TCID50值。
設(shè)定兩種加藥方式,先加大黃多糖再作用病毒組與先作用病毒后加多糖組,測定多種多糖對新城疫病毒的影響。細(xì)胞病變(CPE)、紫外吸光度值(OD值)及選擇指數(shù)(TI)比較法綜合評價抗病毒效果,TI=最大無毒濃度/最小有效濃度。
2.1 單因素對多糖提取的影響 見圖1~4。
圖1 提取時間的影響
2.2 超聲波法正交設(shè)計試驗結(jié)果 見表3~5。
表3 超聲波法提取大黃多糖正交設(shè)計試驗因素水平L9(34)
根據(jù)R值,影響多糖提取率及多糖含量的主次關(guān)系依次是溫度(C)>料液比(B)>pH值(A)>時間(D);料液比(B)>pH 值(A)>溫度(C)>時間(D)。方差分析顯示,B因素及A因素即料液比和pH值對多糖含量試驗結(jié)果影響顯著。綜合考慮正交試驗結(jié)果,推定超聲波提取大黃多糖的最佳工藝條件是A3B3C1D2,即pH值為9.0,料液比為1∶40,溫度為40℃,時間為50min。條件下提取率及多糖含量為42.27%,13.11%,均高于傳統(tǒng)提取法38.10%,5.06%。
表4 超聲波法提取正交試驗結(jié)果
表5 超聲波法正交試驗方差分析
2.3 大黃多糖抗NDV作用結(jié)果
2.3.1 TCID50與大黃多糖安全濃度 NDV的TCID50為10-6.56,大黃多糖的安全濃度為1mg/mL。
2.3.2 大黃多糖抗NDV活性結(jié)果 大黃多糖抗NDV活性的細(xì)胞病變觀察結(jié)果與MTT測定結(jié)果一致,多糖濃度為1/21mg/mL,抗病毒作用最大,與病毒對照組差異極顯著(P<0.01),抗NDV活性低于陽性對照藥,治療指數(shù)均達(dá)4,體外試驗表現(xiàn)一定細(xì)胞保護(hù)作用和抗NDV作用(見表6)。
根據(jù)大黃藥材目的多糖高溫易變性的特點(diǎn),通過先粉碎中藥再超聲波提取的方法,可低成本獲得高含量、高穩(wěn)定性、低雜質(zhì)的大黃多糖。試驗發(fā)現(xiàn),通過調(diào)節(jié)提取液酸堿度可促進(jìn)大黃多糖的浸出,堿度越大,大黃多糖含量越高,結(jié)合趙燕等[3]阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸5種單糖組成推測,此現(xiàn)象是由于大黃多糖中含有糖醛酸及酸性多糖所導(dǎo)致,但堿濃度過高會導(dǎo)致有些多糖在水解,不利于活性的研究。試驗發(fā)現(xiàn),多糖顏色與提取pH值呈正相關(guān),pH值越大顏色越深,這是由于大黃色素更易溶于堿性溶液中,pH值的增高促進(jìn)了大黃中色素的溶解,增加了后期除色素的困難。
表6 RTP和sRTP各組細(xì)胞CPE和OD值的變化
超聲波提取大黃多糖的最佳工藝條件為pH值9.0,料液比1∶40,溫度40℃,時間50min,這一推定參數(shù)沒在正交試驗表中,后經(jīng)驗證,參數(shù)下提取大黃多糖提取率及多糖含量為42.27%,13.11%,均高于正交試驗組與傳統(tǒng)法提取組。傳統(tǒng)法獲得數(shù)據(jù)38.10%,5.06%,與倪受東[4]研究中多糖含量6.54%接近。超聲波法優(yōu)于紀(jì)耀華等[5]研究的微波法提取大黃多糖的工藝,微波法大黃多糖的最佳工藝條件為提取時間3min,微波功率400W,料液比1∶10,pH值為10。
大黃多糖抗NDV活性試驗,根據(jù)新城疫病毒性疾病的發(fā)病特點(diǎn),結(jié)合可能出現(xiàn)的用藥時機(jī),排除了中藥與病毒自然環(huán)境下作用后再作用細(xì)胞的臨床發(fā)生可能,設(shè)定兩種給藥方式,一種先加大黃多糖作用12h,再加入病毒吸附作用,目的是觀察藥物能否進(jìn)入細(xì)胞或吸附于細(xì)胞表面,以阻止病毒的吸附與侵入[6],另一種先加病毒吸附作用后,再加入大黃多糖,目的是觀察藥物能否對已進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的病毒起作用,抑制其生物合成及成熟釋放[6]。通過MTT檢測細(xì)胞活性結(jié)合CPE的方法發(fā)現(xiàn),大黃多糖在兩種作用方式下對DNV均有抑制作用,先加多糖組抗NDV活性略高于先加病毒組,治療指數(shù)均為4,高于抗病毒藥物研究效果評價中治療指數(shù)大于2的標(biāo)準(zhǔn)。這兩種加藥方式從不同側(cè)面探討了中藥的直接抗病毒機(jī)理,結(jié)果表明大黃多糖在這兩種抗病毒途徑中均發(fā)揮了較好的作用,關(guān)于大黃多糖抗NDV研究的仍無報道,但與任宇皓等[7]人對黃芪多糖,淫羊藿多糖抗NDV活性評價比較,大黃多糖抗NDV的治療指數(shù)4高于黃芪、淫羊藿多糖先加多糖組的3,說明大黃多糖體外抗NDV活性很高,具有研究價值。
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[2]殷震,劉景華.動物病毒學(xué)[M].3版.北京:北京科學(xué)出版社,1997.
[3]趙燕,劉莉,楊興斌,等.中藥大黃多糖中單糖組成的毛細(xì)管區(qū)帶電泳分析[J].分析化學(xué)研究簡報,2006(34):255-258.
[4]倪受東,嚴(yán)德江,徐先祥.大黃多糖的提取及含量測定[J].中國藥業(yè),2007,16(13):10-13.
[5]紀(jì)耀華,紀(jì)躍芝,馬愛民,等.微波法提取大黃多糖最佳工藝優(yōu)化研究[J].中藥材,2009,9:118-120.
[6]李凡,易世紅,趙春艷,等.雙黃連粉針劑抗病毒作用[J].中草藥,2002,33(1):52-54.
[7]任宇皓,胡元亮.黃芪多糖、淫羊霍多糖和淫羊藿總黃酮對NDV,IBDV活性的研究[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2000.