一株酒精酵母的分離及其發(fā)酵性能分析

雙 寶，李 明，李 慧，矯洪濤，李海濤，王 晴，向文勝，高繼國

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)司法鑒定中心，哈爾濱 150030）

隨著科技的不斷發(fā)展，人們對燃料型能源的需求日益加大。這使得石油及煤炭等資源的價(jià)格持續(xù)上升。然而這些資源不僅污染環(huán)境，而且這些資源都是不可再生資源。為此，許多國家都開始將目光轉(zhuǎn)向再生清潔的能源。以生物合成的酒精作為一些燃料能源的代替品或部分代替品可以緩解上述問題。

國內(nèi)許多學(xué)者都對酒精發(fā)酵這一領(lǐng)域進(jìn)行了大量的研究。韋珂等進(jìn)行了玉米免蒸煮生料的酒精發(fā)酵，并對影響其發(fā)酵的主要因素進(jìn)行了正交試驗(yàn)研究[2]。他們發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵劑添加量占原料0.7%，料水比1∶4，起始 pH 5.5，35℃條件下發(fā)酵 4～5 d，發(fā)酵效果較好。盧曉霆[3]等人用10 L發(fā)酵罐為玉米生料進(jìn)行發(fā)酵，通過正交試驗(yàn)得到最佳條件為：酵母0.2%，糖化酶250 U·g-1，纖維化酶0.1%，料水比1∶2.5，攪拌為 140 r·min-1，發(fā)酵溫度 29 ℃，發(fā)酵時(shí)間為 85～95 h。

本研究分離了一株酒精發(fā)酵酵母，并對其進(jìn)行了發(fā)酵性能分析，為酒精的大量生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料

生玉米粉。

1.2 酒糟

生產(chǎn)廢棄酒糟。

1.3 主要試劑

麥芽浸粉(北京奧特星生物技術(shù)責(zé)任有限公司)；α-淀粉酶：酶活力4 000 U·g-1，(北京奧特星生物技術(shù)責(zé)任有限公司)；糖化酶：酶活力100 000 U·g-1(北京奧特星生物技術(shù)責(zé)任有限公司)，酵母粉、蛋白胨（進(jìn)口）；瓊脂 (Agar Powder)Genebase Gene-Tech co.Ltd；葡萄糖 (天津市特迪化工有限公司)；其余化學(xué)試劑均為分析純。

1.4 主要儀器和設(shè)備

超凈工作臺 (蘇凈集團(tuán)安泰公司制造)，PHS-3TC型酸度計(jì) (上海天達(dá)儀器有限公司)，721型分光光度計(jì)(上海第三分儀器有限公司)，HWS24型電熱恒溫水浴鍋 (上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司制造)，DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 (寧波江南儀器廠)，HZQ-R振蕩器 (哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)，高壓蒸汽滅菌鍋(長春百奧生物儀器有限公司)等。

1.5 菌種的分離

1.5.1 配制YEPD培養(yǎng)基

2%葡萄糖，1%酵母膏，2%蛋白胨，121℃條件滅菌20 min。

1.5.2 分離方法

將少量酒糟接種于含氨芐青霉素（Amp）的盛有3 ml YEPD培養(yǎng)基的試管中，30℃搖床培養(yǎng)12 h。將試管菌液稀釋106倍，用涂布棒涂YEPD板（含Amp），30℃過夜培養(yǎng)，待長出菌落后，挑取具有典型酵母菌特征的單菌落進(jìn)行石炭酸堿性復(fù)紅染色[1]鏡檢，將符合酵母細(xì)胞形態(tài)的菌落，接種于試管培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)，當(dāng)菌體達(dá)一定密度后，轉(zhuǎn)接入盛有100 ml YEPD培養(yǎng)基的三角瓶中搖床培養(yǎng)，用于后面試驗(yàn)。

1.6 種子培養(yǎng)基的濃度梯度篩選

1.6.1 麥芽汁培養(yǎng)基的配制

配制0、0.5%、1%、2%、4%濃度梯度的麥芽汁培養(yǎng)基各100 mL于500 mL三角瓶，pH 6.4，121℃條件滅菌20 min。

1.6.2 接種

將少量三角瓶培養(yǎng)基中的酵母菌分別接種于以上濃度麥芽汁培養(yǎng)基中30℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)，每隔1 h測1次OD600值（600 nm下光吸收度），記錄菌體的生長情況，篩選出最適合酵母菌生長濃度的麥芽汁培養(yǎng)基，用于發(fā)酵種子培養(yǎng)基。

1.7 1 L三角瓶發(fā)酵接種量的梯度篩選

1.7.1 接種量梯度

在1 L三角瓶中，按料水比為1∶2，60℃溫水調(diào)漿，加0.1%的α-淀粉酶，70℃水浴50 min，迅速冷卻至60℃，調(diào)pH至4.5～5，加100 U·g-1的糖化酶，冷卻至30℃，接種量按0、10%、13%、16%和20%的梯度接種，密封，30℃靜止發(fā)酵72 h，定時(shí)測定發(fā)酵液中酒精度、殘余總糖、蛋白質(zhì)含量等指標(biāo)。

1.7.2 發(fā)酵液中總糖測定

發(fā)酵液中總糖的水解和提?。喝?5 mL發(fā)酵液，放入100 mL三角瓶中，加10 mL 1 mol·L-1HCl，沸水浴加熱30 min。冷卻后，用6 mol·L-1NaOH中和水解液至中性，過濾，定容獲得總糖提取液。用斐林法測定總糖含量[1]。

1.7.3 發(fā)酵液中蛋白質(zhì)測定

發(fā)酵液樣品做四種方式處理：①發(fā)酵液靜止沉淀，取上清液測定；②發(fā)酵液用濾布過濾，取濾液測定；③發(fā)酵液離心（4 000 r·min-1，20 min），取上清液測定；④發(fā)酵液經(jīng)濾紙過濾后測定。蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[1]。

1.7.4 發(fā)酵液中酒精含量測定

發(fā)酵液樣品處理同上。用比色法測定[1]。

1.8 發(fā)酵罐擴(kuò)大性試驗(yàn)

在發(fā)酵罐中前述試驗(yàn)的最佳接種量、最佳糖化酶及淀粉酶的加入量，靜止發(fā)酵72 h，并定時(shí)測定各項(xiàng)指標(biāo)，方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)

將分離得到的菌株挑單菌落接種于含有100 μg·mL-1Amp的YEPD液體培養(yǎng)基中，30℃ 220 r·min-1搖床培養(yǎng)過夜的菌懸液稀釋106倍后涂含有100 μg·mL-1Amp的YEPD平板，得到的菌落形態(tài)如彩版Ⅰ所示，菌落呈乳白色、圓形，表面光滑，中間濕潤呈乳頭狀。經(jīng)過光學(xué)顯微鏡100倍油鏡觀察，菌體細(xì)胞成卵圓形，有些區(qū)域菌體以鏈狀分布（見彩版Ⅱ）。

2.2 不同濃度麥芽汁培養(yǎng)基對酵母菌生長的影響

由圖1可看出，酵母菌在麥芽汁2%和4%濃度的培養(yǎng)基中長勢好。由于在麥芽汁2%和4%的培養(yǎng)基中的長勢接近，從成本考慮，最終選用麥芽汁2%濃度的培養(yǎng)基作為酵母菌發(fā)酵的種子培養(yǎng)基，酵母菌大約培養(yǎng)15 h達(dá)到對數(shù)生長期。

圖1 不同濃度麥芽汁培養(yǎng)基酵母菌生長趨勢曲線Fig.1 Growth curves of yeast in different consistency culture medium of wort

2.3 接種量對酵母菌發(fā)酵的影響

由圖2可知，20%的接種量，發(fā)酵12 h時(shí)的酒精度達(dá)到2.86%，最終酒精度達(dá)4.71%，整個(gè)發(fā)酵過程的酒精度明顯高于其他接種量。主發(fā)酵期為48 h，之后由于糖化酶的后糖化作用，發(fā)酵液中的酒精度仍有部分增加，發(fā)酵于72 h基本終止。

圖2 不同接種量下酒精度變化曲線Fig.2 Variation curve of alcohol with different inoculation number

由圖3可知，發(fā)酵48 h內(nèi)總糖含量明顯下降，20%的接種量，最終發(fā)酵液中殘余總糖含量為9.45 mg·mL-1，明顯低于其他接種量時(shí)的最終殘余總糖含量。接種量越高最終殘余總糖含量越低，這可能與最終菌體濃度大有關(guān)。因?yàn)?，接種量大，菌體增殖速度加快，代謝旺盛，所以糖的消耗速度也會(huì)加快。

圖3 不同接種量下發(fā)酵殘余總糖含量變化曲線Fig.3 Variation curve of saccharide with different inoculation number

由圖4可知，在整個(gè)發(fā)酵過程中粗蛋白含量相對穩(wěn)定，略有增加，20%的接種量，蛋白含量最大。

圖4 不同接種量下蛋白含量變化曲線Fig.4 Variation curve of protein with different inoculation number

綜上所述，接種量為20%時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)生的酒精含量、總糖的利用率及總蛋白的產(chǎn)生都優(yōu)于其他接種量，故本試驗(yàn)以后步驟選用20%的接種量進(jìn)行。

2.4 擴(kuò)大培養(yǎng)結(jié)果

在100 L發(fā)酵罐中按前面步驟得出的最佳接種量加入，料液總體積30 L左右，其余條件不變，按步驟活化菌種、調(diào)漿、接種，靜止發(fā)酵162 h，定時(shí)測定各項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果如表1所示，總糖含量不斷下降，粗蛋白含量基本不變，說明該酵母利用蛋白并不明顯，酒精度則不斷提高，而酸度則是先下降再上升。放大到30 L體積發(fā)酵，無論從培養(yǎng)基組成還是培養(yǎng)工藝方面都發(fā)生了很大的變化，整個(gè)酒精發(fā)酵過程還受糖化劑反應(yīng)速度的影響，發(fā)酵周期延長，最終酒精含量明顯提高。

表1 一個(gè)發(fā)酵周期各項(xiàng)參數(shù)的變化Table 1 Variation of every parameter in fermentation

3 討論

目前在國內(nèi)，許多學(xué)者對酒精發(fā)酵的研究主要集中在培養(yǎng)基的篩選、培養(yǎng)條件的優(yōu)化及抗性酵母的篩選和研究。

酒精發(fā)酵常用的培養(yǎng)基有玉米粉[2-5]和大米[6]，也有以糖蜜、甘蔗、木薯和大麥為原料的[7-8]。本研究采用的大麥汁與前人采用的大麥原料相比更便于酵母的吸收和利用。但由于成本較高，所以僅限于實(shí)驗(yàn)室研究。對于生產(chǎn)而言，我們將進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基。

對培養(yǎng)條件的優(yōu)化，主要以正交試驗(yàn)為主，如張春野[10]，葉向庫[11]，武賢峰利用此法最終得到了較優(yōu)的工藝條件[12]。段學(xué)輝等研究了分批培養(yǎng)、分批補(bǔ)料及連續(xù)流加培養(yǎng)對酒精酵母細(xì)胞生長的影響[9]。本試驗(yàn)用的是單因子優(yōu)化法，該優(yōu)化方法每次都可以優(yōu)化一個(gè)因子，所以設(shè)計(jì)起來比較簡單，無先后順序，對數(shù)學(xué)知識要求較少[13]，當(dāng)然也存在一定缺陷，那就是對于各因子之間的交互作用沒有體現(xiàn)。

對抗逆性強(qiáng)的酵母的篩選和研究也有較多報(bào)道，如易弋等從酒精廠廢液、糖廠廢糖蜜、土壤及淤泥等七種不同樣品中篩選得到了酒精耐受性較好的酵母菌株[14]；宋瑤等則篩選獲得1株能在33～42℃生長良好的抗高溫酵母菌株[15]；李榮杰研究了超高濃度酒精發(fā)酵條件下酵母菌生理代謝的變化[16]。本文采用Amp初篩酵母菌，是因?yàn)锳mp主要對細(xì)菌有抑制作用。而酵母為真菌，對Amp不敏感。而且，由于分離菌株所用的材料為酒糟，這就使得篩選出酒精高耐受菌的可能性大大提高。

在國外，不少研究者，在研究酒精發(fā)酵的同時(shí)，還進(jìn)行了酵母核酸方面的研究[17-19]。所以，下一步我們將通過16 SRNA對該菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，并進(jìn)行深入研究，為其開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

本文通過抗生素與稀釋涂平板聯(lián)用的方法從酒糟中分離出來一株酒精酵母菌株，通過單因子優(yōu)化法發(fā)現(xiàn)，當(dāng)麥芽汁為2%，接種量為20%時(shí)，該酒精酵母的發(fā)酵性能最好，為酒精發(fā)酵的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

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