楊蘭 謝小冬 馬力揚(yáng) 劉志壽 潘玉蘭 劉顏彬

（1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院 口腔科，蘭州 730030；2.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 遺傳學(xué)研究所，蘭州 730000；3.西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院 口腔教研室，蘭州 730030；4.臨夏州人民醫(yī)院 口腔科，臨夏 731200；5.臨夏州廣河縣人民醫(yī)院 口腔科，臨夏 731203）

慢性牙周炎是一種多種病因?qū)е碌募?xì)菌感染炎癥性疾病，但遺傳因素也對患病易感性有不可忽視的作用，免疫相關(guān)因子的基因型可能決定個(gè)體對牙周炎的易感性[1]。白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1是一類重要的具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，既可促進(jìn)結(jié)締組織基質(zhì)的降解，也可刺激骨吸收。有研究發(fā)現(xiàn)：IL-1與慢性炎癥的活躍性有密切關(guān)系[2]。國內(nèi)外學(xué)者對IL-1B＋3954位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與慢性牙周炎發(fā)生的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了多方面研究，許多等位基因的頻率因地域、種族的差別而有所改變，得出的結(jié)論有時(shí)也是矛盾的[3-7]。本實(shí)驗(yàn)通過病例對照研究，觀察中國甘肅省回族、東鄉(xiāng)族人群IL-1 SNP與成人慢性牙周炎易感性的關(guān)系，探討中國少數(shù)民族慢性牙周炎易感因素。

1 材料和方法

1.1 研究對象的選擇

選擇甘肅臨夏回族、東鄉(xiāng)族慢性牙周炎患者215例作為牙周炎組?；刈寤颊咧心行?8人，女性47人；東鄉(xiāng)族患者中男性60人，女性30人?；刈寤颊吣挲g為35～70歲，平均年齡54歲；東鄉(xiāng)族患者年齡35～67歲，平均50歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）三代均系回族、東鄉(xiāng)族血統(tǒng)；2）年齡35～74歲；3）至少有14顆牙，其中4顆磨牙；4）6個(gè)月內(nèi)無牙周治療史；5）本人知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）有明顯錯(cuò)畸形及局部刺激因素者；2）有全身系統(tǒng)性疾病者；3）吸煙者，孕期及哺乳期婦女。同時(shí)選取219個(gè)全身健康無系統(tǒng)性疾病者作為正常對照組，其中回族患者120人，東鄉(xiāng)族患者99人；男性100人，女性119人，年齡為30～65歲，平均年齡53歲。

由2位經(jīng)過培訓(xùn)的專科主治醫(yī)師對所有受檢者進(jìn)行全口牙周檢查。記錄口腔中所有余留牙6個(gè)部位（近中頰面、頰面、遠(yuǎn)中頰面、近中舌面、舌面、遠(yuǎn)中舌面）的牙周袋探診深度（probing depth，PD）及臨床附著喪失（clinical attachment loss，CAL），檢查結(jié)果參照Armitage推薦的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，根據(jù)檢查結(jié)果將CAL>1.6mm、口內(nèi)至少3個(gè)區(qū)或至少6顆牙8個(gè)以上鄰面部位CAL>3mm、缺失牙>2顆（第三磨牙拔除、正畸牙拔除、外傷脫落牙、大面積齲失牙及先天缺牙除外）者納入病例組。正常對照組：平均CAL≤0.5mm，無鄰面部位的CAL≥3mm，缺失牙≤2顆（第三磨牙拔除、正畸牙拔除、外傷脫落牙、大面積齲失牙及先天缺牙除外）。

1.2 主要儀器

低溫臺式離心機(jī)MIRKO-22R（Hettich Zentrifugen公司，德國），TL-16型臺式高速冷凍離心機(jī)（上海市離心機(jī)械研究所），UV7501紫外分光光度計(jì)（上海天美科學(xué)儀器有限公司），超凈工作臺（蘇凈集團(tuán)安泰公司制造），電泳儀JY-ECP 3000和JY-600（北京市君意機(jī)電技術(shù)公司），電子恒溫水箱（北京永光明醫(yī)療儀器廠）等。

1.3 主要試劑

蛋白酶K（Merck KgaA公司，德國），瓊脂糖（BIOWEST公司，西班牙），Taq DNA polymerase和10mmol·L-1dNTP mixture（北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心），Alu I（TOYOBO Co.LTD，日本），Aval、Taq1（MBI Fermentas公司，立陶宛），Bsh1236I（Fermentas Life Science公司，立陶宛），BstU I（New England Biolabs公司，美國）。飽和酚（pH>7.8）、氯仿、異戊醇、無水乙醇、溴化乙錠（ethidium bromide，EB）等化學(xué)試劑以及引物均購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

取研究對象前臂靜脈血2mL，用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白酶K及酚-氯仿有機(jī)抽提法從乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝的外周血白細(xì)胞中提取DNA，提取的DNA溶于TE緩沖液中，置4℃保存。

采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）對IL-1B+3954等位基因進(jìn)行分型。PCR引物F：5’-GTTGTCATCAGACTTTGACC-3’，R：5’-TTCAGTTCATATGGACCAGA-3’。PCR反應(yīng)體積為25μL。PCR條件：先行3個(gè)循環(huán)的變性（95℃，2min）、復(fù)性（55℃，90 s）和延伸（74℃，1min）；后接32個(gè)周期變性（94℃，1min）、復(fù)性（55℃，1min）和延伸（74℃，1min）；最后72℃延伸10min。經(jīng)2%瓊脂糖電泳確定有一條249 bp帶后，將PCR產(chǎn)物用限制酶Taq1在65℃消化16 h。C等位基因含Taq1限制位點(diǎn)，酶切后產(chǎn)生135 bp和114 bp兩條帶；T等位基因不能被Taq1消化，只有249 bp一條帶。2.5%瓊脂糖凝膠（EB染色）電泳分析。T/T=249 bp，C/C=135 bp+114 bp，C/T=249 bp+135 bp+114 bp[156，44]。30%的標(biāo)本被再次進(jìn)行基因分型，已確認(rèn)結(jié)果的可靠性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，各基因多態(tài)性位點(diǎn)的等位基因頻率用Hardy-Weinberg平衡檢測，并經(jīng)χ2檢驗(yàn)確定差異有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各等位基因的頻率以及基因型的分布頻率用優(yōu)勢比（odds ratio，OR）及其95%可信區(qū)間（95%confidence interval，95%CI）表示相對風(fēng)險(xiǎn)度分析。二組之間在年齡、性別上的差異用χ2檢驗(yàn)確定有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

本研究對牙周炎組215例和正常對照組219例進(jìn)行檢測，所檢測的全部基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡，二組之間在年齡、性別上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.1 IL-1B+3954基因多態(tài)性

牙周炎組IL-1B+3954位點(diǎn)C/C、C/T和T/T基因型的頻率分別為75.3%（162/215）、15.8%（34/215）、8.8%（19/215）；正常對照組相應(yīng)基因型的頻率分別為57.1%（125/219）、28.3%（62/219）、14.6%（32/219）。牙周炎組的基因型頻率分布與正常對照組的基因型頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

牙周炎組IL-1B+3954位點(diǎn)C、T等位基因頻率分別為83.3%（358/430）、16.7%（72/430）；正常對照組相應(yīng)等位基因頻率分別為71.2%（312/438）、28.8%（126/438）。2組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。根據(jù)OR值判斷，C等位基因相對于T等位基因?yàn)槲ｋU(xiǎn)基因，即攜帶等位基因C比攜帶等位基因T患牙周炎的風(fēng)險(xiǎn)高2.008倍（P＜0.05）。

2.2 IL-1B+3954基因多態(tài)性在回族與東鄉(xiāng)族患者中的分布頻率

牙周炎組回族患者IL-1B+3954位點(diǎn)C/C、C/T、T/T基因型的頻率分別為72.0%（90/125）、19.2%（24/125）、8.8%（11/125）；東鄉(xiāng)族患者相應(yīng)基因型的頻率分別為80.0%（72/90）、11.1%（10/90）、8.9%（8/90）。3種基因型在牙周炎組回族患者和東鄉(xiāng)族患者間分布頻率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

牙周炎組回族患者IL-1B+3954位點(diǎn)C、T等位基因的頻率分別為81.6%（204/250）、18.4%（46/250）；東鄉(xiāng)族患者相應(yīng)等位基因的頻率分別為85.6%（154/180）、14.4%（26/180）。2種等位基因在牙周炎組回族和東鄉(xiāng)族患者間分布頻率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

牙周炎是一種多基因、多因素疾病，不同種族、民族所攜帶的易感基因以及誘導(dǎo)的環(huán)境因素可能不同[9]。通過分析不同民族的基因多態(tài)性，對疾病的發(fā)病機(jī)制、基因水平的診斷和治療有重要意義。本研究從基因水平探討甘肅回族、東鄉(xiāng)族人群慢性牙周炎發(fā)病的遺傳學(xué)原因并與其他民族比較，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段，為甘肅回族、東鄉(xiāng)族中慢性牙周炎相關(guān)易感基因的分布和分型提供了基本數(shù)據(jù)，為慢性牙周炎的分子分型、分子診斷和基因治療提供一定的理論依據(jù)。

自從1997年Kornman等[7]首次將IL-1基因的多態(tài)性引入到慢性牙周炎的關(guān)聯(lián)研究中，發(fā)現(xiàn)IL-1A-899和IL-1B+3953與牙周炎的易感性有關(guān)以來，Cullinan等[10]對504名志愿者做長期縱向追蹤研究IL-1和牙周炎進(jìn)展的關(guān)系，結(jié)果顯示具有IL-1基因多態(tài)性的個(gè)體比沒有IL-1變異的個(gè)體更容易有附著喪失，證明IL-1和牙周病的進(jìn)展相關(guān)。李啟艷等[11]通過提取122例侵襲性牙周炎患者和95例健康對照者外周靜脈血基因組DNA進(jìn)行研究，分析了IL-1A+4845、IL-1B+3954、IL-1B-511多態(tài)性，得出IL-1A+4845、IL-1B-511位點(diǎn)的SNP可能與中國人群中男性個(gè)體的侵襲性牙周炎易感性有關(guān)，而未發(fā)現(xiàn)IL-1B+3954的多態(tài)性與侵襲性牙周炎的易感性有關(guān)。

Nikolopoulos等[12]關(guān)于牙周疾病及細(xì)胞因子基因多態(tài)性關(guān)系的研究中，綜合分析了23篇IL-1B SNP對慢性牙周炎易感性作用的文章，肯定了IL-1B+3954多態(tài)性是慢性牙周炎患病的危險(xiǎn)因素的結(jié)論。本研究對甘肅臨夏回族自治州的回族及東鄉(xiāng)族慢性牙周炎易感性與IL-1B+3954基因多態(tài)性的相關(guān)性分別進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示：IL-1B+3954基因型頻率分布在慢性牙周炎組與正常對照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示其基因多態(tài)性與回族及東鄉(xiāng)族慢性牙周炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有顯著的相關(guān)性。IL-1B+3954位點(diǎn)C等位基因在牙周炎組占83.3%，明顯高于正常對照組中的71.2%的比例，二者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明在IL-1B+3954中，隨著C等位基因頻率的升高，發(fā)生牙周炎的比例明顯升高，提示C等位基因與牙周炎的患病風(fēng)險(xiǎn)有相關(guān)性。Moreira等[13]在對巴西人的研究中發(fā)現(xiàn)：與侵襲性牙周炎組和對照組相比，IL-1B+3954在慢性牙周炎組中T等位基因占有更高的比例。上述不同研究結(jié)果的產(chǎn)生可能與種族影響基因多態(tài)性分布有關(guān)[4]，同時(shí)提示IL-1基因型在不同地域、不同人種中的分布是不相同的[14]。

本研究表明牙周炎組回族患者IL-1B+3954位點(diǎn)C/C、C/T、T/T基因型及C、T等位基因的頻率和東鄉(xiāng)族患者間分布頻率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。這可能是由于回族和東鄉(xiāng)族在民族的形成和發(fā)展中有著相同或相近的淵源，遺傳距離很近[15]。

牙周炎的發(fā)生是遺傳、環(huán)境以及個(gè)人行為習(xí)慣等因素共同作用的結(jié)果，要揭示牙周炎發(fā)生的可靠易感性標(biāo)志物，尚需綜合其他基因位點(diǎn)共同分析，將遺傳與環(huán)境的相互作用、聯(lián)系納入研究范圍之內(nèi)，只有這樣才能為將來對危險(xiǎn)人群進(jìn)行早期的診斷和治療打下良好基礎(chǔ)。

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