池肇春

準種（quasispecies）是指同種遺傳差異性的概念，在乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染者體內，常形成以一個優(yōu)勢株為主的相關突變株病毒群稱為HBV準種，它是由一種母序列和來自該系列的大量相關突變體所組成的病毒基因組。HBV病毒種群間基因序列的差異，一般不超過核苷酸總長度的2%～5%。因此，HBV準種是指由遺傳學上高度相關，個體之間又有微小差別的HBV種群，在自身和外界因素的影響下優(yōu)勢和劣勢種群的構成又處于不斷變化之中。近幾年來在慢乙肝抗病毒治療的患者中發(fā)現(xiàn)存在準種基因變異。且越來越多的研究證實，HBV準種的產生與抗病毒治療的耐藥相關。影響抗病毒療效因素很多，包括人體免疫狀況、病毒準種、基因變異，在難治性病例中準種可能占重要因素。

一、抗病毒治療患者肝內外HBV的分子特征

核苷類似物特異性地結合于HBV聚合酶的底物結合部位，影響病毒復制。如果HBV聚合酶區(qū)基因突變，將導致某些特定部位的氨基酸被置換，使之與藥物的結合力下降，從而引起藥物敏感性降低和耐藥。目前已知常見的耐藥突變位點主要見于逆轉錄酶（RT）的A，B，C，D區(qū)。

在HBV復制途徑一個有錯誤傾向的逆轉錄酶，潛在產生藥物耐藥準種。長期接受抗病毒治療的患者，在肝細胞、周圍血單核細胞（PBMC）HBV變異的程度尚不明了。當藥物耐藥和分子變異時患者血漿中有可能不能檢出HBV DNA。有報告從9例接受肝移植的乙肝患者，用敏感的PCR/核酸分子雜交方法評價NBV基因組，肝和PBMC有HBV DNA者檢測CCCDNA。結果HBV DNA血漿檢出率為43%（3/7），肝100%（9/9），PBMC 83%（5/6） 檢出 HBV DNA，HBV CCCDNAD在全部9例肝中檢出，PBMC有1例檢出。4例患者臨床診斷耐藥。HBV P基因 系列顯示，野生型HBV在血漿100%（2/2），PBMC 83%（5/6），但肝僅 33%（3/9） 檢出 HBV P，而且 66%對拉米夫定（LAM）和（或）阿德福韋酯（ADV）耐藥。轉S基因不影響HBV抗原性。從肝有抗病毒耐藥突變顯示，患者之間的準種差異甚大，盡管表現(xiàn)HBV抑制，但在肝卻持續(xù)證實存在HBV復制，且可能檢出肝外HBV。最后認為藥物耐藥與肝內病毒準種有關[1]。

有人研究LAM、ETV（恩替卡韋）序貫病毒治療HBV準種群體的演變及其臨床意義。劉霖等[2]對2例采用LAM-ETV序貫的治療出現(xiàn)不同臨床結果的患者進行了近4年的隨訪，用多聚酶鏈反應-克隆-測序的方法研究HBV準種組成的長期動態(tài)演變，用最大似然法建立遺傳進化樹分析代表序列的遺傳進化關系，結合血清學和病毒學指標分析HBV準種演變與臨床過程的關系。結果2例患者出現(xiàn)了LAM耐藥病毒學反彈，采用ETV治療后，1例患者獲得持續(xù)病毒學反應，另1例患者用ETV治療72周后又出現(xiàn)病毒學反彈。病毒學反彈均發(fā)生在原有對藥物敏感的優(yōu)勢準種被耐藥株替代時。ETV耐藥與rtL180M＋S202G＋M204VDGDG三聯(lián)突變株成為優(yōu)勢準種密切相關。結論認為，HBV準種組成與核苷類藥物敏感性密切相關。LAM耐藥株可進一步演變?yōu)镋TV耐藥株，因此，對使用核苷類藥物治療的患者進行HBV準種監(jiān)測具有重要臨床意義。由于長期用核苷類或核苷類似物抗HBV治療，往往出現(xiàn)一種或多種藥物耐藥，為了提高抗病毒治療效果，因此了解病毒準種特異突變菌株的發(fā)生機制也是一個重要的問題，特殊的病毒株在特殊的環(huán)境內可產生HBV準種[3]。

新近國內用實時熒光PCR（RT-PCR）定量，來評估ADV耐藥時的HBV準種。此方法對ADV耐藥的HBV準種的敏感性和特異性100%。在32例臨床患者中20例檢出rtA181T和 rtN236T突變，20例中有 8例為雙倍體rtA181T和rtN236T 突變[4]。

二、慢性HBV感染HBV準種的分子特征和功能分析

HBV自然地發(fā)生突變在HBV相關疾病的發(fā)病機理上可能發(fā)揮作用。有人研究慢性HBV患者全長HBV準種的分子特征和功能分析。Cui[5]等測定自然發(fā)生的和1例慢性乙肝患者進行全長HBV準種的功能分析。10個HBV克隆分離標本的基因型 均為B4基因型和亞型adw。多數(shù)克隆標本，氨基酸取代和核苷酸改變發(fā)生在核心蛋白、X蛋白和核心啟動子的特定部位。在核心蛋白10個克隆標本有8個是cl3L，cL60M，和cl97L。10個克隆標本全部檢出cP130T。在X蛋白5個克隆標本檢出xl127M，在基底核心啟動子僅在1個克隆標本發(fā)現(xiàn)A1762T/G1764A突變，2個克隆標本在核苷1772和1773之間插入11-bp（堿基對）。6個克隆標本在復制能力水平上競爭復制出現(xiàn)變異。結論指出，準種HBV病毒基因變異顯示有不同的突變類型。

在慢性感染HBV的個體，HBV準種的高度差異可增加HBV基因的變異，贊成對核苷/核苷酸類似物（NUCs）耐藥于治療前已存在的觀點。Pollicino等[6]在不治療的HBsAg攜帶者與LAM耐藥患者就HBV逆轉錄結構域和重迭S基因進行比較。從100例不治療和59例LAM耐藥患者分離完整的HBV，了解它們逆轉錄結構域和重迭S基因情況。結果不治療組未檢出原發(fā)性突變對核苷/核苷酸類似物耐藥，但有46例（46%）變異聯(lián)合繼發(fā)的或伴發(fā)的突變，4例患者突變修飾S蛋白抗原性。在LAM耐藥組，除了原發(fā)LAM耐藥突變外，檢出69.5%（41/59）有原發(fā)和繼發(fā)聯(lián)合突變，其重要性在于LAM引起RT（逆轉錄酶）突變，2例患者停止編碼重迭S基因和修飾S蛋白抗原性。另9例患者停止修飾S蛋白抗原性。結論指出，HBV突變伴有對NUCs耐藥，在大多數(shù)感染未治療的患者可能已經存在對NUCs耐藥，在LAM治療期間發(fā)生基因變異也可能帶來基因突變，支持對其他NUCs耐藥和（或）潛在S蛋白免疫反應性改變。

一個3年的前瞻性研究HBV單一感染和HIV-HBV聯(lián)合感染患者，分析HBV在核心底部啟動子（BPC）和核心前基因（precore，Pc）部位有基因不均一性。39例HBV感染患者，20例為HBV單一感染，19例與HIV聯(lián)合感染，分離HBV 82份標本，研究BPC/Pc基因部位準種水平。結果HBV單一感染和與HIV聯(lián)合感染患者中HBV主要為A2基因型。BCP突變單一感染患者比聯(lián)合感染者多見（P＜0.0001），Pc突變主要來自e抗原陰性的HBV單一感染患者。HBV與HIV聯(lián)合感染時HBV的特征，在BPC調節(jié)部位傾向于野生型的基因類型較多，Pc部位突變取決于基因型，但與HIV聯(lián)合存在無關[9]。隱匿性HBV（O-HBV）感染在血清的特征是存在HBV DNA和HBsAg陰性，雖然HBV/HIV聯(lián)合感染時O-HBV較多見，但有關HBV突變這一方面的分析研究不多。Martin等[7]報告33例HIV陽性血清標本、27例慢性HBV（C-HBV）和6例O-HBV感染者的血清標本，顯示前S、S擴增。由于O-HBV S基因、前S基因突變，改變了抗原分泌和（或）減少復制而導致HBsAg不能檢出[8]。

三、HBV準種與藥物反應和耐藥的相關性

研究表明，核苷類似物的不同反應性與HBV存在準種現(xiàn)象有著密切的關系。如果我們能夠檢測患者血清中HBV準種特點，又能清楚了解到不同準種的HBV對不同藥物敏感性的差別，就有可能優(yōu)化抗病毒治療的藥物的選擇和方案的制定，從而提高抗病毒治療的效果。

根據(jù)HBV DNA序列的不同，將HBV分成不同的基因型。由于HBV基因的多樣性表現(xiàn)為8個基因型（A-H）。HBV的自然經過和對治療的反應可受HBV基因型的影響。HBV含有4個開放閱讀框架，即前S/S基因、前核心/核心基因、聚合酶基因和X基因。當HBV缺乏校閱能力時周轉率很高，結果大量準種自然產生。前S基因突變時，即使有 HBV復制也可不能檢出HBsAg，S基因突變引起抗HBs結合親和力降低，前核心突變時消除HBeAg，而基部核心啟動子突變產生HBeAg基因下調?；亢诵膯幼油蛔儼橛蠬BV復制增加和進展性肝病發(fā)生，如肝硬化、肝細胞癌發(fā)生率高。聚合酶基因突變常由抗病毒治療失敗引起。若抗病毒治療前已存在突變則限制了抗病毒藥物的進一步選擇[9，10]。因此，了解HBV變異和突變在診斷和處理HBV感染上至關重要。目前研究證實LAM耐藥主要是由rtM204V/I/S原發(fā)耐藥突變以及rtL180M、rtV173L等繼發(fā)補償突變所致。替比夫定（dT）耐藥突變與LAM相似。ADV耐藥主要與rtN36T或vtA181V原發(fā)耐藥突變相關。ETV耐藥突變包括rtM204和rtL180突變位點以及rtT184、rtS202G或rtM250其中一個ETV原發(fā)耐藥突變位點。

研究認為，耐藥突變的氨基酸替換形式可影響病毒的耐藥性與復制能力。如上所述，不同的核苷類似物產生的耐藥突變位點不一樣，因此開展病毒種群大規(guī)模測序，不但可以找到已知突變位點，同時也可發(fā)現(xiàn)新的突變位點，加深對病毒耐藥形成機制的認識。

HBV感染是一動力過程，由于藥物耐藥突變，持續(xù)抗病毒治療可引起突變缺失。收集LAM治療失敗，后來改用阿德福韋酯（ADV）患者HBV DNA是順序在兩個不同的區(qū)域，一個是逆轉錄1kb區(qū)域，另一個是在C基因和部分前S基因在1.5kb區(qū)域，RT（逆轉錄酶）區(qū)域的序列分析指出，改用ADV后LAM耐藥突變減少，最終突變不能檢出。研究發(fā)現(xiàn)，兩種抗病毒治療之間在C和前S區(qū)域準種分布和缺失類型也是不同，LAM治療標本野生型株57.7%是在結構域，缺失在前S區(qū)域。持續(xù)治療可影響到ADV，病毒群在C基因占優(yōu)勢包含86%為81和96bp缺失，兩者較多的缺失包含T和B細胞抗原決定部位。由于C基因抗原決定部位缺失伴有LAM耐藥突變的逐漸消失，可持續(xù)對存活的HBV進行抗病毒治療[11]。Margeridon-Thermet等[14]對HBV準種用焦磷酸測序（UDPS）來了解核苷/核苷類似物耐藥突變，G到A高突變由脫輔基脂蛋白B信使核糖核酸編輯酶介導，由于NRTI（核苷/核苷類似物逆轉錄酶抑制劑）耐藥突變，用UDPS可檢出流行率低的HBV變異。

在臨床上有些耐藥病例并沒有檢測到已知耐藥相關突變，但臨床仍表現(xiàn)耐藥，除宿主因素外，可能與基線時準種的組成有關。多數(shù)研究者認為，病毒準種異質性越大，組成準種的病毒株越復雜，其適應環(huán)境變化的能力就越強，抗病毒治療的難度也就越大。此外，NAs耐藥補償突變位點、不同基因型、混合感染等均與抗病毒反應有關，有待今后作更深入的研究。

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