夏 凡，楊麗君，王 靜，李兆杰，劉玉敏

（威海出入境檢驗檢疫局，山東威海264200）

病原性海洋弧菌致病機理及其快速檢測方法研究進展

夏 凡，楊麗君*，王 靜，李兆杰，劉玉敏

（威海出入境檢驗檢疫局，山東威海264200）

病原性海洋弧菌是引起我國特別是沿海地區(qū)細菌性食物中毒危害的首要食源性致病菌。本文重點綜述了病原性海洋弧菌中能引發(fā)人類重要疾病的副溶血弧菌、霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌的致病機理以及目前國內(nèi)外關(guān)于其的各種檢測方法、原理、應(yīng)用及研究進展。

病原性，海洋弧菌，快速檢測，研究進展

病原性海洋弧菌是一群在海洋環(huán)境中最常見，廣泛分布于內(nèi)灣、沿岸、外洋水域、沉積物和海洋生物體中，可能感染魚類或人類，可在人群中引起暴發(fā)性食物中毒的一類條件致病菌，是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要限制性因素。早在1970年，Tubiash等［1］就證實弧菌是長牡蠣和歐洲扁牡蠣幼體壞死性疾病的病原菌。迄今已被報道過的海水養(yǎng)殖動物病原弧菌有20多種，其中，副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、溶藻弧菌（V.alginolyticus）、創(chuàng)傷弧菌（V.vulnificus）、哈維氏弧菌（V.harveyi）、鰻弧菌（V.anguillarum）、燦爛弧菌（V.splendidus）等10多種弧菌已被認為是魚類的重要致病菌。某些種類也會導(dǎo)致人或其他動物發(fā)病，但以霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌三者最重要，且為人所熟知。國家食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，1992～2001年的十年間我國微生物性食物中毒的病原分布發(fā)生了顯著變化，由副溶血弧菌引發(fā)的食物中毒發(fā)生規(guī)模及人群暴露規(guī)模呈明顯上升趨勢，均已超過沙門氏菌食物中毒，躍居首位，特別是在沿海省份，由該菌引起的食物中毒占細菌性食物中毒總數(shù)的比例高達60%以上。另外，隨著海水養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展，特別是高密度養(yǎng)殖模式的推廣，養(yǎng)殖生物的細菌性疾病發(fā)生頻率和范圍也逐漸增大，近幾年，我國出口的水產(chǎn)品曾發(fā)生過多起因病原性弧菌超標引起的退貨、銷毀、取消注冊代號事件，造成了巨大的經(jīng)濟損失。因此病原性海洋弧菌的快速檢測技術(shù)，對維持水產(chǎn)養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展、水產(chǎn)品衛(wèi)生質(zhì)量監(jiān)督和保護公眾健康等方面都具有十分重要的意義。本文重點綜述了病原性海洋弧菌中能引發(fā)人類重要疾病的副溶血弧菌、霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌的致病機理以及目前國內(nèi)外關(guān)于其的各種檢測方法、原理、應(yīng)用及研究進展。

1 病原性海洋弧菌致病機理研究進展

病原性弧菌主要通過兩種途徑引起人和動物感染，一種為經(jīng)腸道感染引起胃腸炎或腹瀉，如副溶血弧菌、霍亂弧菌等；另一種為經(jīng)中耳炎、傷口感染引起敗血癥，如創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌等。Elston和Leibovitz［2］通過研究美洲牡蠣幼體弧菌病證實了弧菌的致病性取決于其與宿主細胞間的相互作用，包括黏附、侵襲、定居、體內(nèi)增殖、產(chǎn)生毒素及宿主死亡等致病過程，在長牡蠣、歐洲扁牡蠣、硬殼蛤的許多致病性研究中也都證實了類似的結(jié)果。其致病作用主要是在其侵襲和生長繁殖過程中對機體細胞、組織造成的損傷以及其代謝產(chǎn)物對機體局部乃至全身的正常新陳代謝或機能造成的干擾和破壞。病原性弧菌的重要致病因子有如下幾種。

1.1 黏附素

細菌黏附于宿主細胞表面是侵入宿主并有效發(fā)揮毒素使機體感染致病的先決條件?；【哂卸喾N粘附素，大體分為兩大類：菌毛粘附素和非菌毛粘附素，前者包括鞭毛、纖毛等；后者有脂多糖（LPS）、外膜蛋白（OMP）等。

多數(shù)弧菌具有運動性，有單根或周身鞭毛，它們可借助于這一特殊結(jié)構(gòu)粘附于消化道等器官粘膜上皮細胞表面。Nakasone等［3］發(fā)現(xiàn)從血清型為03：K2的副溶血弧菌中純化的纖毛能夠黏附在兔腸道絨毛上皮細胞上，當(dāng)用纖毛抗體Fab片段處理菌體細胞后，則會失去對兔腸道絨毛上皮細胞的黏附作用，表明纖毛在副溶血弧菌的黏附和定植過程中發(fā)揮了重要作用，并且證實侵襲力是其毒力的一部分。Uchimura等［4］報道，菌毛在創(chuàng)傷弧菌、最小弧菌的致病過程中介導(dǎo)菌體遠距離的黏附，但其機理尚未清楚。

脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌細胞壁中的主要成分之一，是細菌內(nèi)毒素的主要物質(zhì)，具有種屬特異性。副溶血弧菌、霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌的脂多糖都被證明與其致病過程有關(guān)，是重要的致病因子。

外膜蛋白（OMP）是細菌外膜的主要結(jié)構(gòu)，它不僅與粘附作用有關(guān)，而且與菌株的毒力也有密切關(guān)系，OMP還能與細菌的脂多糖（LPS）結(jié)合成復(fù)合物，該復(fù)合物不僅與細菌的自凝有關(guān)還與粘附有關(guān)。有研究顯示，霍亂弧菌的純化外膜蛋白的抗體可以抑制其在小鼠腸粘膜上的粘附。有一種分子量為77kDa的OMP，定名為IrgA，其表達受鐵濃度的調(diào)節(jié)，被認為是霍亂弧菌對小鼠有毒力的重要因素［5］。

1.2 胞外酶

目前已發(fā)現(xiàn)副溶血弧菌、霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌均可產(chǎn)生胞外酶，具有多種酶活性，可產(chǎn)生強烈的致病作用，且致病作用大致相同：破壞宿主體質(zhì)，分解破壞其組織成分；破壞機體凝血系統(tǒng)的酶活性；破壞血細胞導(dǎo)致溶血；破壞血清的免疫功能等。

1.2.1 溶血素 溶血素是副溶血弧菌致病的主要因素，已被證明是一種細胞毒素和誘導(dǎo)酶［6］。Tanaka等研究發(fā)現(xiàn)，在有水解產(chǎn)物存在的條件下，它的產(chǎn)生量為非誘導(dǎo)條件下的40倍左右。目前研究較多的有不耐熱溶血素（TLH）、耐熱直接溶血素（TDH）、耐熱直接相關(guān)溶血素（TRH）。TLH、TDH和TRH分別由tlh、tdh和trh基因編碼。除副溶血弧菌外，非O1群霍亂弧菌也可能攜帶tdh基因，可能是因為tdh基因通過與一段插入序列相連構(gòu)成轉(zhuǎn)移復(fù)合物在弧菌中相互傳播的原因。

TDH和TRH具有直接溶血活性，可使多種紅細胞發(fā)生溶血，人類的紅細胞對TDH較敏感。這一溶血過程是通過溶血素與宿主的紅細胞膜結(jié)合后，在其表面成孔并最終導(dǎo)致紅細胞膠樣滲透溶解來實現(xiàn)的。此外，TDH還具有細胞毒活性，可使細胞膜上形成小孔通道，引起細胞外Ca2+濃度增加，從而引起Ca2+激活的Cl-分泌增加，當(dāng)細胞滲透壓的改變超過細胞自身調(diào)節(jié)的能力時，將使細胞發(fā)生病理和形態(tài)學(xué)改變，導(dǎo)致細胞膨脹甚至死亡。TDH還具有腸毒素活性，心臟毒性和致死作用［7］。

近些年的研究發(fā)現(xiàn)，TLH是一種非典型的磷脂酶，也能夠溶解人的紅細胞，但需要卵磷脂具有溶血活性。國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)無論是臨床分離株還是環(huán)境分離株都含有 tlh基因，并具有種屬特異性。Gooch等［8］利用TLH的種屬特異性對tlh制備基因探針檢測貝類等海產(chǎn)品，發(fā)現(xiàn)其比傳統(tǒng)的檢測方法具有更加快速、穩(wěn)定等優(yōu)點。

1.2.2 金屬蛋白酶與溶細胞素 金屬蛋白酶（metaloprotease）是創(chuàng)傷弧菌產(chǎn)生的一種能消化膠原和彈性蛋白的胞外酶，與宿主組織損害及皮膚水腫形成有關(guān)，通過激活血漿緩激肽的級聯(lián)放大作用，使血管通透性增大，有利于創(chuàng)傷弧菌從腹腔入侵血液，同時還通過降解Ⅳ型膠原破壞血管基底膜，最終引起皮膚出血。也有國外學(xué)者認為金屬蛋白酶對創(chuàng)傷弧菌毒性的產(chǎn)生并不重要，在該菌的毒力中可能存在多因素相互作用，蛋白酶在其中所占的比重尚不清楚。

創(chuàng)傷弧菌溶細胞素（VVC）是由結(jié)構(gòu)基因vvhA編碼的能使細胞形成孔道的細胞毒素，由大多數(shù)致病菌株產(chǎn)生，能溶解哺乳動物紅細胞及中國倉鼠卵巢（CHO）細胞，具有血管滲透因子活性，毫克以下水平即可對腹腔注射實驗鼠致死。目前對VVC的細胞毒性機制已有廣泛研究和報道，但其確切機制尚未完全明了，就目前的研究結(jié)論認為其毒性是通過與靶細胞膜結(jié)合及形成跨膜孔道；發(fā)揮誘導(dǎo)作用，產(chǎn)生超氧陰離子，介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流，促進一氧化氮合酶（NOS）大量釋放，引起細胞凋亡；誘導(dǎo)肥大細胞中組胺釋放；誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞表達粘附分子；受金屬蛋白激酶等其他因素調(diào)節(jié)來實現(xiàn)的［9-11］。Kim等［12］研究認為，VVC經(jīng)膽固醇介導(dǎo)能與紅細胞膜結(jié)合并聚合成四聚體，從而在細胞膜上形成直徑約1nm的孔道。Park等［15］也報道VVC屬于孔型成蛋白中的膽固醇依賴型溶細胞素（CDC）家族。Kwon等［13］在研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)VVC的濃度達到0.4HU/mL時，產(chǎn)生的超氧陰離子可誘導(dǎo)細胞凋亡。Kim等［14］研究進一步證實VVC提高了肺內(nèi)皮細胞Ca2+水平，激活了肺內(nèi)皮細胞，引起其表面黏附分子的表達增加，使肺血管通透性增大，導(dǎo)致急性肺損傷。

1.3 整合子系統(tǒng)

在霍亂弧菌的基因組上發(fā)現(xiàn)了一類整合子，它們都攜帶一個整合酶基因和一個特異性的附著位點，能從其他微生物捕獲外源性的開放讀碼框（ORF）或基因盒，并把它們轉(zhuǎn)化為有功能的基因?；魜y弧菌存在這樣一個獨特的整合子系統(tǒng)，可能在霍亂弧菌獲取致病基因的過程中發(fā)揮作用。目前，所發(fā)現(xiàn)的整合子多與抗生素抗性基因相關(guān)，因此與霍亂弧菌的流行性也有一定關(guān)系。

1.4 其它致病因子

研究發(fā)現(xiàn)，霍亂弧菌的致病性是由幾個致病因子共同作用的結(jié)果。主要致病因子有3個：CTX基因元件，其中的ctxAB基因編碼霍亂毒素（CT）；TCP致病性島，它編碼TCP菌毛；toxR，一個基本的毒力調(diào)節(jié)基因，編碼CT和TCP的基因都由toxR基因調(diào)控。Wang等［15］發(fā)現(xiàn)甲基轉(zhuǎn)移酶基因位于副溶血弧菌的22.79kb致病島，它的存在與弧菌的毒力因子的相關(guān)性超過98%。

2 病原性海洋弧菌快速檢測方法研究進展

近年來隨著免疫學(xué)、分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，國內(nèi)外學(xué)者不斷努力，已研究了很多快速、簡便、特異、敏感、低耗且適用的病原菌快速檢測法，尤其是基因探針和PCR技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，已逐漸取代傳統(tǒng)的生化實驗，明顯提高了細菌的診斷水平。

2.1 免疫學(xué)檢測技術(shù)

免疫學(xué)檢測技術(shù)是一種利用抗原抗體的特異性反應(yīng)，并結(jié)合一些生物化學(xué)或物理學(xué)方法而建立起來的病原檢測技術(shù)。主要包括酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)等。

2.1.1 酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù) 酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)（ELISA）是將抗原、抗體的特異性免疫反應(yīng)及酶的高效催化反應(yīng)有機結(jié)合起來的一種定性和定量的綜合性技術(shù)。該技術(shù)從抗體的包被到酶聯(lián)顯色都日趨成熟和完善，易于制備試劑盒，操作簡單，與其他檢測方法相比，具有特異性強、敏感性高、檢測時間短等優(yōu)點。目前在國內(nèi)外已廣泛應(yīng)用于病原性海洋弧菌的快速檢測。但該技術(shù)也有其缺點，主要是制備抗體需進行吸附處理以去除交叉反應(yīng)。何彬斌等［16］建立了副溶血弧菌的間接ELISA快速檢測法，檢出限達到了105CFU/mL，且與其它菌株均無交叉反應(yīng)，具有較高的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性，能夠快速、準確地對副溶血弧菌進行檢測。竇勇等［17］建立的副溶血弧菌間接ELISA快速法，將檢出限提高到104CFU/mL，與之相比提高了一個數(shù)量級。目前，南方醫(yī)科大學(xué)流行病學(xué)系的研究者將tlh基因進行了克隆，制備了抗TLH多克隆抗體，同時聯(lián)合兔抗副溶血弧菌多克隆抗體建立了ELISA雙抗體夾心法。該研究雖未對其直接檢測效果做出評價，但卻為利用TLH的種特異性檢測副溶血弧菌的感染情況提供了依據(jù)［18］。

2.1.2 膠體金免疫層析技術(shù) 膠體金免疫層析技術(shù)是以膠體金作為示蹤標志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型免疫標記技術(shù)。滴加在試劑條一端的樣品受膜的毛細管作用向另一端移動，移動過程中目標菌與固定在膜上某一區(qū)域的受體結(jié)合而被固相化顯色，無關(guān)物質(zhì)則越過該區(qū)域而被分離，然后通過標記物顯色來判定實驗結(jié)果。膠體金免疫層析法特異性高、靈敏度好，不僅能檢測活菌，還能檢測死菌。應(yīng)用該方法對水產(chǎn)品中的霍亂弧菌進行檢測，陰性者可直接報告，由于目前我國對霍亂弧菌的膠體金免疫層析法還沒有具體的標準，只能作為初篩實驗，陽性者需進一步結(jié)合生化及血清學(xué)實驗進行分離鑒定。

2.2 基因檢測技術(shù)

基因檢測技術(shù)主要是以病原的核酸結(jié)構(gòu)及其組成部分為研究對象，并結(jié)合一些生物化學(xué)手段來鑒定病原的一種檢測技術(shù)。目前在病原性海洋弧菌的檢測中應(yīng)用比較多的是基因探針技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)、16SrRNA檢測技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)等。

2.2.1 基因探針技術(shù) 基因探針技術(shù)是利用特定標記的DNA或RNA探針和病原中與探針互補的靶核苷酸序列進行雜交，以此來確定宿主是否攜帶有病原體的一類基因檢測技術(shù)。該技術(shù)以其檢驗快速、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，20世紀90年代以來，已廣泛應(yīng)用于多種病原性海洋弧菌的檢測［19］。目前，國內(nèi)外研究者已建立了多種針對編碼病原性海洋弧菌毒力基因的探針技術(shù)。美國FDA-BAM推薦利用堿性磷酸酶（AP）和地高辛（DIG）標記DNA探針雜交檢測副溶血性弧菌的 tlh、tdh和 trh基因，采用VVAP探針進行創(chuàng)傷弧菌特異性計數(shù)。

Lee等［20］根據(jù)tdh基因的核苷序列，合成了副溶血弧菌特異性地寡核苷酸探針，可特異地與89株副溶血性弧菌分離株的DNA雜交，不與其他菌雜交；探針靈敏度約為1×106CFU/g，可直接用于人工染菌食品的檢測。Raghunath等［21］用AP標記的寡核苷酸探針檢測海產(chǎn)品中trh+的副溶血弧菌。結(jié)果表明，該探針的特異性為100%、靈敏度為5.0×102～3.4× 103CFU/g，能特異的對海產(chǎn)品中trh+的副溶血弧菌進行快速檢測。McCarthy等［22］評價了檢測副溶血弧菌tlh基因的AP和DIG標記探針，研究發(fā)現(xiàn)，兩種探針的特異性很好，與API20E鑒定系統(tǒng)的符合率分別為97%和98%。Lee等［23］采用基因探針的夾心雜交法檢測海產(chǎn)品副溶血弧菌的tlh基因，能把每克牡蠣組織里10個副溶血弧菌檢測出來。該方法易于制成試劑盒，目前，美國市場上已有銷售，該產(chǎn)品操作簡單、重復(fù)性好、靈敏度高、特異性好，能進行臨床大規(guī)模的快速檢測。近年來，國外一種快速測定副溶血性弧菌總量的疏水網(wǎng)格膜過濾技術(shù)開發(fā)成功，它也是一種 DNA探針技術(shù)，增菌后 1d即可完成測定［24］。

Nair等［25］在研究O139群和O抗原基因中發(fā)現(xiàn)了兩個O139群特異片段2R1和2R3，2R1長100bp，2R3長1000bp，可將它們尤其是2R3作為探針，用于O139群的特異檢測。Wright等［26］根據(jù)創(chuàng)傷弧菌溶細胞素結(jié)構(gòu)基因vvhA，合成了AP標記寡核苷酸探針（VVAP），雜交結(jié)果與脂肪酸圖譜和API20E的鑒定結(jié)果一致，該探針可直接檢測天然污染和人工染菌的環(huán)境樣品，無需進行增菌或選擇性平板分離。

2.2.2 熒光定量PCR技術(shù) 熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。熒光定量PCR技術(shù)根據(jù)熒光能量傳遞原理，融合了PCR技術(shù)的高效性，探針技術(shù)的高特異性，光譜技術(shù)的高敏感性和高精確性等優(yōu)點，目前已成為分子生物學(xué)中一種強有力的快速檢測手段。熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為 TaqMan熒光探針和 SYBR熒光染料。Blackstone等［27］建立了1種基于TaqMan探針的快速定量檢測含tdh基因副溶血弧菌的熒光定量PCR方法，該實驗的DNA靈敏度為1CFU/PCR體系，實驗快速、準確，整個反應(yīng)1h內(nèi)就可完成。Ward等［28］建立了基于TaqMan探針檢測貝類中副溶血弧菌tlh、tdh、trh和ORF8基因的復(fù)合熒光定量PCR方法，可用于檢測基因組DNA和純培養(yǎng)物，其靈敏度分別為200pg和1×104CFU/mL。Panicker等［29］建立了采用SYBR Green 1DNA結(jié)合染料檢測創(chuàng)傷弧菌vvhA基因的熒光定量PCR方法，84株創(chuàng)傷弧菌都出現(xiàn)陽性擴增結(jié)果，非目標弧菌的擴增結(jié)果都為陰性，牡礪組織或海水的檢出限為100CFU，增菌5h檢出限降至1CFU。曲梅等［30］建立了基于TaqMan探針檢測霍亂弧菌ctxAB和zot毒力基因的熒光定量PCR方法。該方法檢測其他腸道致病菌無交叉反應(yīng)，檢測限可達到2～20CFU/mL。

隨著生態(tài)環(huán)境的變化和抗生素的濫用，許多致病菌引起的臨床癥狀越來越不典型，常常需要同時檢測多種致病基因才能確定病原。而多重實時PCR技術(shù)為同時檢測多個基因或多種細菌提供了可能，對各類病原性海洋弧菌的監(jiān)控檢測有著重要的價值。

2.2.3 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù) 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP）是一種新的分子生物學(xué)方法，它在恒溫條件下實現(xiàn)核酸擴增。該技術(shù)依賴于能夠識別靶DNA上6個特定區(qū)域的4條引物和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下高效擴增核酸，1h即可完成，反應(yīng)產(chǎn)物是由多重復(fù)靶序列的莖-環(huán)狀和花椰菜狀DNA組成的混合物，具有高特異性、快速靈敏、高效、操作簡便等特點［31］。目前，該技術(shù)在臨床疾病的診斷、流行性細菌或病毒的定性、定量檢測以及環(huán)境安全監(jiān)測等方面應(yīng)用廣泛。應(yīng)用LAMP技術(shù)檢測病原性海洋弧菌國外未見文獻報道，近兩年，國內(nèi)學(xué)者開發(fā)出了檢測副溶血弧菌的LAMP方法，具有較強的指導(dǎo)意義。徐芊等［32］建立了副溶血弧菌LAMP檢測方法，1h即可完成。針對副溶血弧菌tlh基因，設(shè)計了4條特異性引物，對12種細菌共28株菌進行LAMP擴增，僅副溶血弧菌得到陽性結(jié)果；副溶血弧菌基因組DNA和純培養(yǎng)物的檢測靈敏度分別為90fg/LAMP反應(yīng)體系和24CFU/mL，檢測限為89CFU/g。研究表明，該方法檢測副溶血弧菌特異性強、靈敏度高，并且操作簡便、快捷、檢測成本低。王麗等［33］利用LAMP法對市售不同水產(chǎn)品來源的副溶血弧進行快速檢測，同時將檢測結(jié)果與PCR方法進行比較。結(jié)果表明，LAMP方法的最低檢出限為10CFU/mL，PCR方法為103CFU/mL，LAMP方法檢測靈敏度是PCR方法的100倍，特別適合于現(xiàn)場快速診斷。

2.2.4 基因芯片技術(shù) 基因芯片技術(shù)是近年發(fā)展起來的，廣泛應(yīng)用于基因序列分析、雜交、基因突變檢測、基因組文庫圖型分析以及致病菌基因診斷等領(lǐng)域的一項技術(shù)［34］。該技術(shù)可同時將大量不同的探針固定于同一支持物上，因而可以一次性對同一樣品進行大量序列檢測和核酸分析，能夠滿足在實際檢驗工作中的快速、高通量、自動化檢測的要求，并可以克服上述其他技術(shù)存在的問題，具有廣闊的發(fā)展前景。國內(nèi)外關(guān)于應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測水產(chǎn)動物疾病方面的研究均處于起步階段。Gonzalez等［35］用多重PCR和由9種短核苷酸探針構(gòu)建DNA芯片的方法，同時檢測副溶血弧菌與創(chuàng)傷弧菌等5種病原性海洋弧菌，7種與病原菌染色體互補的探針檢測靈敏度為100%。Panicker等［36］建立了檢測和鑒定牡蠣中副溶血弧菌、霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌的DNA芯片方法。結(jié)果證明，用基因芯片能成功檢測到1g牡蠣組織均漿中1CFU的弧菌，對這3種弧菌的PCR擴增產(chǎn)物能廣泛、可靠、靈敏的分析。

2.3 變性高效液相色譜技術(shù)

變性高效液相色譜（DHPLC）是利用離子對反向高效液相色譜原理，通過一個DNA分離柱，進行核苷酸片段的分離和分析，是近幾年發(fā)展起來的一種快速檢測PCR擴增產(chǎn)物的新技術(shù)。具有自動化、快速、檢出率高、檢測DNA片段大小范圍廣等優(yōu)點，已被證實為一種高性價比的檢測技術(shù)。曹際娟等［37］以PCR-DHPLC法對54株霍亂弧菌參考菌株進行了檢測，并和常規(guī)分離培養(yǎng)進行了比較，陽性率為19%，與常規(guī)分離培養(yǎng)比較，符合率為100%。這種檢驗方法特異性強，簡便快捷，為霍亂防治提供了一種有效的檢測新手段。

2.4 顯色培養(yǎng)基技術(shù)

顯色培養(yǎng)基技術(shù)是近年來開發(fā)的新型快速檢測法，通過在分離培養(yǎng)基中加入細菌特異性酶的顯色底物，直接根據(jù)菌落顏色就可以對菌種做出鑒定，減少了進行純培養(yǎng)和生化鑒定的步驟，極大提高了檢測效率。張淑紅等［38］設(shè)計開發(fā)了一種靈敏性與CHROMagar vibrio和TCBS平板相當(dāng)?shù)?、用于分離檢測副溶血弧菌的新型顯色培養(yǎng)基HKC vibrio，可應(yīng)用于人工污染樣品和實際樣品檢驗。近年來，有研究人員也開發(fā)出一種比TCBS具有更強特異性的、用于副溶血弧菌分離檢測的選擇性顯色培養(yǎng)基BCVM。副溶血性弧菌在BCVM上形成紫色菌落，能明顯區(qū)分創(chuàng)傷弧菌形成的藍綠色菌落。經(jīng)分別采用BCVM和TCBS對來自于牡蠣及其生長環(huán)境的296株副溶血弧菌進行比較研究，結(jié)果顯示BCVM選擇性為94%，而TCBS僅達77%［39］，該結(jié)果提示BCVM有可能成為一種直接平板計數(shù)培養(yǎng)基，用于食品中副溶血弧菌的快速定量檢測。鑒于BCVM的高度特異性，研究人員開發(fā)出一種類似于傳統(tǒng)平板計數(shù)法的，用于副溶血性弧菌定量的雙層培養(yǎng)基平板計數(shù)法（DLAP）。該培養(yǎng)基有兩層，底層為BCVM，上層為含1.5%NaCl的TSA。經(jīng)驗證，該方法能有效恢復(fù)受熱或冷傷害的副溶血弧菌的活力，可以作為MPN法的一種替代方法，用于副溶血性弧菌的快速測定［40］。

3 前景與展望

病原性海洋弧菌的檢測技術(shù)已由傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測法發(fā)展到免疫學(xué)和分子生物學(xué)檢測技術(shù)，其方法由簡單到復(fù)雜，檢測結(jié)果也越趨精確。分子生物學(xué)技術(shù)可從基因水平考察細菌的流行病學(xué)狀況，不僅能檢出陽性菌株，還能判定其是否攜帶毒力基因，能夠為食源性疾病的流行病學(xué)調(diào)查提供有力的支持，大大提高了預(yù)防、撲滅疾病爆發(fā)的能力。微生物快速檢測領(lǐng)域尚有一些實用性較強的方法。例如，生物傳感器技術(shù)、免疫磁性分離技術(shù)、焦磷酸測序技術(shù)等，其中不少可以制成商品試劑盒或?qū)崿F(xiàn)自動化。然而，各種快速檢測方法各有其長處和不足，在定性與精確定量兩方面難以兼顧。就目前國內(nèi)外研究情況來看，分子生物學(xué)技術(shù)在科研領(lǐng)域中應(yīng)用較多，通常用在流行病學(xué)研究中，考察細菌的來源、傳播途徑和地域性差別，在實際檢驗工作中由于相對要求較高，推廣應(yīng)用上有一定難度。值得注意的是，近年來基因芯片技術(shù)已成為檢驗領(lǐng)域里強有力的武器，能夠?qū)崿F(xiàn)如副溶血弧菌等病原微生物的自動化檢驗。如果能形成產(chǎn)業(yè)化規(guī)模效應(yīng)，大大降低成本后，不論在科研領(lǐng)域還是生產(chǎn)實踐中都有十分廣闊的應(yīng)用空間。目前，病原性海洋弧菌的檢測，應(yīng)視具體情況靈活掌握，應(yīng)將傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測方法、現(xiàn)代免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法三種技術(shù)結(jié)合起來應(yīng)用，充分發(fā)揮其綜合優(yōu)勢，方能達到既快速準確，又經(jīng)濟、簡便的目的。

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Research progress in pathogenetic mechanism and rapid detection of pathogenicm marine vibrio

XIA Fan，YANG Li-jun*，WANG Jing，LI Zhao-jie，LIU Yu-min
（Weihai Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau，Weihai 264200，China）

Pathogenicm marine vibrio is recognized as a principal pathogenetic microorganism which could cause disserve of bacterial food poisoning in China specially in littoral of our country.Vibrio parahaemolyticus，Vibrio cholerae and Vibrio vulnificus could cause serious disease of human.Pathogenetic mechanism，methods of rapid detection，principles，application and research progress in the world of the three vibrios were summarized.

pathogeny；marine vibrio；rapid detection；research progress

TS201.1

A

1002-0306（2011）01-0366-06

2009-12-04 *通訊聯(lián)系人

夏凡（1983-），男，碩士，研究方向：食品安全檢測。