Survivin在腎盂移行細胞癌和輸尿管移行細胞癌中的表達

羅小瑾 ，尉立京，鄒國平，胡 群

（1.宜春市人民醫(yī)院泌尿外科，江西 宜春 336000；2.山東大學山東省立醫(yī)院泌尿外科，濟南 250021）

腎盂和輸尿管移行細胞癌是泌尿系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤，早期診斷、及時治療是改善預(yù)后的關(guān)鍵。目前，腎盂和輸尿管移行細胞癌的術(shù)前診斷主要依靠影像學檢查和尿細胞學檢查［1］。建立快速、特異、非侵入性的檢測方法將有利于腎盂和輸尿管移行細胞癌的早期診斷，特別對治療后監(jiān)測復(fù)發(fā)有著重要的意義。為此本研究對腎盂和輸尿管移行細胞癌患者的手術(shù)摘除標本與尿脫落細胞中存活素（Survivin）［2］的表達進行了分析研究，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集1995年4月至2010年4月在山東省立醫(yī)院泌尿外科和宜春市人民醫(yī)院泌尿外科住院治療的腎盂和輸尿管移行細胞癌患者158例。1）根據(jù)WHO行病理分級:腎盂移行細胞癌113例（腎盂癌組），男 71 例，女 42 例，年齡 35～80 歲，平均 57.8歲。其中Ⅰ級28例、Ⅱ級61例、Ⅲ級24例。輸尿管移行細胞癌45例（輸尿管癌組），男30例，女15例，年齡40～76歲，平均56.7歲。其中Ⅰ級 11例、Ⅱ級27例、Ⅲ級7例。另選擇腎積水、重復(fù)腎等非腫瘤患者的腎盂標本10例作為陰性對照（對照組）。2）選取腎盂移行細胞癌患者尿脫落細胞標本25例，男16例，女9例，年齡41～66歲，平均54.3歲。 其中Ⅰ級7例、Ⅱ級12例、Ⅲ級6例。輸尿管移行細胞癌患者尿脫落細胞標本10例，男6例，女4例，年齡40～76歲，平均 56.3歲。其中Ⅰ級3例、Ⅱ級 5例、Ⅲ級2例。另選擇腎積水、重復(fù)腎等非腫瘤患者10例為對照組。所有腎盂和輸尿管移行細胞癌的診斷均經(jīng)術(shù)后病理證實。

1.2 主要試劑

Survivin單克隆抗體、鏈酶親和素－生物素－過氧化物酶免疫組化染色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 檢測方法

1）手術(shù)標本按病理科常規(guī)處理。免疫組化染色采用鏈霉菌抗生物素蛋白——過氧化物酶連接法（SP法）。常規(guī)石蠟切片、脫蠟、水化、微波抗原修復(fù)（10 mmol·L－1檸檬酸緩沖液，pH6.0），過氧化氫（H2O2）作用5 min后加Survivin抗體，SP法嚴格按試劑說明書標準步驟進行，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。用免疫組化圖像分析系統(tǒng)分析陽性率，測定陽性細胞吸光值。2）取200 mL新鮮尿液離心棄上清，對沉渣中紅細胞先用紅細胞溶解液［氯化銨（NH4CL）155 mmol·L－1、碳酸鉀（K2CO3）10 mmol·L－1、乙二胺四乙酸（EDTA）1 mmol·L－1］作用 5 min 加以破壞，離心，棄上清液，取細胞沉渣涂片。涂片干燥后用4%多聚甲醛固定5 min，微波抗原修復(fù)，H2O2作用5 min后加Survivin抗體，嚴格按標準SP步驟進行，過氧化物酶顯色。

1.4 結(jié)果判定標準

Survivin陽性表達以胞質(zhì)內(nèi)是否出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒為判斷標準。高倍顯微鏡下觀察10個視野計數(shù)，計算其陽性表達的百分率。陰性（－）:陽性細胞＜10% ；弱陽性（＋）:陽性細胞≥10%～30%；陽性（?）:陽性細胞為＞30%～50%；強陽性（?）:陽性細胞＞50%。

1.5 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計學分析。采用Chi－square 和 Fisher’s確切概率法進行 χ2檢驗，相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤組織中Survivin的表達情況

腎盂癌組113例患者腎盂組織中Survivin陽性表達68例，陽性表達率為60.1%，對照組的腎盂組織中陽性表達率為0.0%，2組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；在輸尿管癌組 45 例患者中，Survivin 陽性表達25例，陽性表達率為55.6%，對照組Survivin陽性表達率為0.0%，2組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。Survivin 的表達率隨著腎盂和輸尿管移行細胞癌組織的病理分級、分期的升高而增高（P＜0.05或 P＜0.01）；Survivin 的表達率與性別及年齡無關(guān)（均 P＞0.05）。

2.2 隨訪情況

腎盂癌組113例患者中隨訪超過1年的有93例，20例失訪。93例患者中Survivin陽性者54例，其中24例復(fù)發(fā)，Survivin陽性者復(fù)發(fā)率為 44.4%；Survivin陰性者39例，其中10例復(fù)發(fā)，Survivin陰性者復(fù)發(fā)率為25.6%，2者復(fù)發(fā)率比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。輸尿管癌組45例患者中隨訪超過1年者有36例，9例失訪。36例患者中Survivin陽性者23例，其中復(fù)發(fā)11例，Survivin陽性者復(fù)發(fā)率為47.8%；Survivin陰性者13例，其中復(fù)發(fā)4例，urvivin陰性者復(fù)發(fā)率為30.76%，2者復(fù)發(fā)率比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。腎盂癌組隨訪超過 5 年者 41例，其中 Survivin 陽性 23 例，5 年生存率為 34.8%（8／23）；Survivin 陰性 18 例，5 年生存率為 55.6%（10／18），2組生存率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。輸尿管癌組隨訪超過5年的19例，其中Survivin陽性11例，5 年生存率為 36.4%（4／11），Survivin 陰性 8 例，5 年生存率為 62.5%（5／8），但 2 組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 尿脫落細胞涂片中Survivin的表達

腎盂癌組25例患者行尿脫落細胞涂片，24例Survivin陽性表達，陽性率為96.0%；輸尿管癌組10例患者行尿脫落細胞涂片，Survivin表達均為陽性，陽性率為100.0%；對照組10例患者尿脫落細胞Survivin表達均為陰性。腎盂癌組、輸尿管癌組Survivin表達陽性率與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。尿脫落細胞Survivin檢測診斷腎盂和輸尿管移行上皮細胞癌的敏感性與特異性分別為 96.0%和 100.0%。

3 討論

Survivin是1997發(fā)現(xiàn)的一種細胞凋亡抑制蛋白，它具有2種功能:抑制細胞凋亡與調(diào)節(jié)細胞周期，是迄今發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑制因子［2］。Survivin主要通過3種方式直接或間接抑制Caspase活性而抗凋亡［2］，其表達具有細胞周期性，只在G2／M期表達。在大多數(shù)惡性腫瘤中都有表達，而在除胚胎期外的正常組織中（胎盤和胸腺除外）均不表達。Survivin與膀胱移行細胞癌關(guān)系的研究較多，也有了很大的進展，它的高敏感性和高特異性已引起了泌尿外科醫(yī)生的注意。本研究中的尿液Survivin蛋白檢測為腎盂癌和輸尿管癌的診斷提供了一種高敏感性、高特異性和無創(chuàng)的檢測指標，其敏感性為96.0%，特異性為 100%［3］。本研究結(jié)果表明:Survivin在各級腎盂移行細胞癌和輸尿管移行細胞癌中均有不同程度的表達，是判斷腎盂移行細胞癌和輸尿管移行細胞癌的標志物。

腎盂移行細胞癌和和輸尿管移行細胞癌均是泌尿外科的常見疾病，臨床癥狀以全程無痛性肉眼血尿為主，但有時也以腰痛、乏力、發(fā)熱等為始發(fā)癥狀，即使目前輔助檢查多樣，但有時仍然很難與腎結(jié)核、腎癌、黃色肉芽腫性腎盂腎炎、輸尿管結(jié)石相鑒別。而膀胱癌患者有膀胱鏡檢查作為診斷膀胱移行上皮細胞癌的金標準［4］，所以筆者認為對疑有腎臟占位的患者，如果腎盂移行細胞癌的可能性大，但同時又不好與其他占位性病變相鑒別，可以查尿中Survivin的表達，如果Survivin為陽性可以在排除膀胱癌及輸尿管移行細胞癌的情況下，診斷為腎盂移行細胞癌，為決定治療方案提供很好的證據(jù)。如果患者輸尿管擴張伴實性病變則可以通過CT或MR，輔助檢測尿液中Survivin的表達，能及時地發(fā)現(xiàn)輸尿管移行細胞癌。

腎盂移行細胞癌及輸尿管移行細胞癌與Survivin的關(guān)系，目前國內(nèi)外報道甚少。由于腎盂輸尿管移行細胞癌與膀胱移行細胞癌起源相同，都是泌尿系移行細胞。近年來雖有一些新的方法可以直接從尿液標本中得出診斷指標，但由于其對Ⅰ級腎盂移行細胞癌存在特異性與敏感性不高的缺陷而未能在臨床上推廣應(yīng)用［5］。Survivin是新近發(fā)現(xiàn)的一種細胞凋亡抑制蛋白，它具有2種功能:抑制細胞凋亡與調(diào)節(jié)細胞周期［2］，在大多數(shù)惡性腫瘤中都有表達，而在除胚胎期外的正常組織中都不表達（胎盤和胸腺除外）［2］。這種特異性表達使人們把它和惡性腫瘤的診斷聯(lián)系了起來。本研究結(jié)果表明，Survivin在各級腎盂移行細胞癌和輸尿管移行細胞癌中均有不同程度的表達，Survivin的表達使移行細胞癌的凋亡受到抑制［6］，對化療與放療的抵抗性增強［7］。這些因素是否與腎盂輸尿管移行細胞癌的高復(fù)發(fā)率直接有關(guān)還未能明了。本研究結(jié)果顯示，Ⅲ級腎盂移行細胞癌和Ⅲ級輸尿管移行細胞癌組織中Survivin表達均呈強陽性，故認為Survivin與腫瘤細胞的分化程度有關(guān)。本研究對10例非泌尿系統(tǒng)腫瘤患者及25例腎盂移行細胞癌患者中尿脫落細胞行Survivin檢測，診斷腎盂移行細胞癌的敏感性為96.0%、特異性為100.0%，10例輸尿管移行細胞癌中尿脫落細胞Survivin檢測診斷輸尿管移行細胞癌的敏感性為100%、特異性為100%。因此，這一方法可作為腎盂移行細胞癌和輸尿管移行細胞癌的早期診斷及治療后監(jiān)測復(fù)發(fā)的指標，可提高腫瘤細胞的檢出率，尤其對Ⅰ級腎盂輸尿管移行細胞癌。用Westernblot和逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法可以測出尿脫落細胞中Survivin的存在，用ELISA方法測定Survivin抗體的濃度來診斷腫瘤，目前也處在實驗階段［8］。從尿脫落細胞涂片中觀察Survivin的表達，標本容易收集，采用常規(guī)的免疫組化方法即可直接檢測到Survivin，方法簡單，而且尿液中紅細胞與白細胞對本檢測無干擾。所以筆者認為，本法作為診斷腎盂輸尿管移行細胞癌的篩選方法，但必須要有陰性和陽性對照以減少假陽性和假陰性，特別是Ⅰ級腎盂輸尿管移行細胞癌標本中Survivin表達濃度低，如果不重視陰性和陽性對照就會影響檢測的準確性。

［1］Brown G A，Matin S F，Busby J E，et al.Ability of clinical grade to predict final pathologic stage in upper urinary tract transitional cell carcinoma:implications for therapy［J］.Urology，2007，70（2）:252－256.

［2］Ambrosini G，Adida C，Altieri D C.A novel anti－apoptosis gene，survivin，expressed in cancer and lymphoma ［J］.Nature Med，1997，3（8）:917.

［3］Duffy M J，O’Donovan N，Brennan D J，et al.Survivin:a promising tumor biomarker［J］.Cancer Lett，2007，249（1）:49－60.

［4］Singh R P，Tyagi A，Sharma G，et al.Oral silibinin inhibits in vivo human bladder tumor xenograft growth involving downregulation of surviving［J］.Clin Cancer Res，2008，14（1）:300－308.

［5］Pennati M，F(xiàn)olini M，Zaffaroni N.Targeting survivin in cancer therarpy［J］.Expert Opin Ther Targets，2008，12（4）:463－476.

［6］Wang X L，Hou J Q，Wen D G，et al.Effects of survivin small interfering RNA on biological behaviors of bladder cancer T24 cells［J］.Ai Zheng，2008，27（3）:253－257.

［7］Ma A C，Lin R，Chan P K，et al.The role of survivin in angiogenesis during zebrafish embryonic development［J］.BMC Dev Biol，2007，7:50.

［8］Tian B，Wang Z，Zhao Y，et al.Effects of curcumin on bladder cancer cells and development of urothelial tumors in a rat bladder carcinogenesis model［J］.Cancer Lett，2008，264（2）:299－308.