張 恒，楊洪吉

(1.瀘州醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，四川瀘州646000;2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院器官移植中心，四川成都610072)

隨著臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展和免疫抑制劑的開發(fā)利用，器官移植已經(jīng)成為治療終末期器官衰竭患者的首選方法。然而臨床同種器官移植面臨著越來越嚴(yán)重的供器官短缺局面，這就促使人們對(duì)異種移植進(jìn)一步的探索。由于豬易于飼養(yǎng)繁殖，器官尺寸與人類相匹配，生理和代謝方面與人類近似，人豬共患病發(fā)生可能較小，涉及倫理問題較少，并可通過基因修飾來增強(qiáng)供體器官的匹配性，所以是公認(rèn)的最適合用作異種移植供體的物種[1]。但作為遠(yuǎn)緣移植，將產(chǎn)生遠(yuǎn)比同種移植或近緣異種移植更強(qiáng)烈和更復(fù)雜的免疫排斥反應(yīng)，包括超急性排斥反應(yīng)(hyperacute rejection，HAR)、延遲性異種移植排斥反應(yīng)(delayed xenograft rejection，DXR)、急性及慢性異種排斥反應(yīng)。隨著清除補(bǔ)體(應(yīng)用眼鏡蛇毒因子等)、免疫吸附、血漿置換、器官吸附等方法的應(yīng)用和轉(zhuǎn)人補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白(complement regulatory protein，CRP)基因豬、αGal抗原基因敲除(1，3-galactosyltransferase geneknockout，GTKO)豬的問世[2]，使 HAR 的免疫屏障得以控制，目前影響異種移植走向臨床的主要免疫學(xué)障礙是DXR。因此，研究異種移植中DXR的發(fā)生機(jī)制及其應(yīng)對(duì)策略具有重要的意義。

1 延遲性異種移植排斥反應(yīng)的機(jī)制

DXR是近緣器官移植或控制了HAR的遠(yuǎn)緣移植在恢復(fù)血流24小時(shí)內(nèi)所發(fā)生的、移植后數(shù)天至數(shù)周內(nèi)移植物喪失活性的過程。目前認(rèn)為，DXR主要是由體液免疫所介導(dǎo)的排斥反應(yīng)，但細(xì)胞免疫也參與其中，其主要特點(diǎn)是：①供者器官移植物血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活;②受者單個(gè)核細(xì)胞(主要是單核-巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞)向供者器官移植物內(nèi)浸潤(rùn)。一方面，內(nèi)皮細(xì)胞激活后，發(fā)生多基因的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生和分泌多種凝血因子和促炎癥因子，引起以炎癥為特征的病理變化;另一方面，單個(gè)核細(xì)胞的募集、浸潤(rùn)，并表達(dá)可與IgG抗體結(jié)合的IgG Fc受體，二者結(jié)合后識(shí)別內(nèi)皮細(xì)胞表面的抗原，誘發(fā)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。兩者共同作用最終引發(fā)類似于HAR的移植物水腫、間質(zhì)出血和血管內(nèi)凝血，導(dǎo)致移植物失活[3]。研究表明，DXR發(fā)生和發(fā)展主要涉及以下三個(gè)因素：內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原與異種反應(yīng)性抗體的結(jié)合、內(nèi)皮細(xì)胞的激活和移植物NK細(xì)胞的活性。

1.1 抗原與異種反應(yīng)性抗體的結(jié)合 目前認(rèn)為異種反應(yīng)性抗體(體內(nèi)的天然抗體和移植后的誘生抗體)是啟動(dòng)DXR的首要因素，這些抗體與供者血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的抗原相結(jié)合，通過激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使內(nèi)皮細(xì)胞活化，引起血管內(nèi)凝血，最終導(dǎo)致移植物壞死。Chen等[4]在豬到狒狒的異種心臟移植中發(fā)現(xiàn)，將表達(dá)人CRP的豬心臟移植到狒狒體內(nèi)后11天內(nèi)，狒狒體內(nèi)逐漸增加的IgM與豬血管內(nèi)皮細(xì)胞上的αGal抗原結(jié)合，導(dǎo)致了DXR的發(fā)生，使移植心臟被排斥。此外，在GTKO豬到狒狒的異種腎移植中，狒狒體內(nèi)誘生的非抗αGal抗體也是導(dǎo)致DXR的重要因素[5]。

1.2 內(nèi)皮細(xì)胞的激活 與HAR中的I型內(nèi)皮細(xì)胞激活(不需要基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的合成)不同，DXR中發(fā)生的是Ⅱ型內(nèi)皮細(xì)胞激活。Ⅱ型內(nèi)皮細(xì)胞激活是以多種基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的合成為特征，包括了NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的參與，使促炎癥因子[E選擇素，細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)及血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)等]、促凝血因子(TF)和其他血栓形成調(diào)節(jié)因子等大量表達(dá)，引起移植物內(nèi)廣泛的炎性改變和血栓形成。目前認(rèn)為Ⅱ型內(nèi)皮細(xì)胞激活是由NF-κB激活介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄激活造成的。在靜息情況下，NF-κB異二聚體在細(xì)胞質(zhì)中與其抑制蛋白I-κB結(jié)合，NF-κB無(wú)法轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄;當(dāng)接受外界信號(hào)[如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、脂多糖(LPS)、氧自由基]刺激時(shí)，I-κB 被磷酸化和泛素化降解，NF-κB轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核，并與DNA的κB反應(yīng)元件結(jié)合，從而啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[6]。有學(xué)者在豬到非人靈長(zhǎng)類的器官移植研究中發(fā)現(xiàn)移植器官的小動(dòng)脈內(nèi)存在激活的血小板、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞有 E選擇素、TF和ICAM-1等表達(dá)，且內(nèi)皮細(xì)胞表面沉積大量纖維蛋白[7]。此外，Vetr等[8]用 TNF、IL-1 或 LPS 激活豬血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)有g(shù)p65和gp100新抗原分子的表達(dá)。

1.3 自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)的活性 NK細(xì)胞主要通過NKR直接識(shí)別靶細(xì)胞或通過FcγRⅢ間接識(shí)別結(jié)合在靶細(xì)胞上的抗體引發(fā)對(duì)靶細(xì)胞的殺傷。有證據(jù)表明，人NK細(xì)胞的抑制受體不能識(shí)別豬的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅰ類分子;其激活受體(主要是NKp44和NKG2D)可直接識(shí)別豬內(nèi)皮細(xì)胞的配體(目前 NKp44所識(shí)別的配體尚不清楚，NKG2D 識(shí)別豬內(nèi)皮細(xì)胞的配體 ULBP-1)[9，10]。二者共同作用造成了NK細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞中黏附、募集，向組織內(nèi)浸潤(rùn)，并主要通過以下兩種機(jī)制引發(fā)DXR：①NK細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的激活：NK細(xì)胞與移植物血管內(nèi)皮細(xì)胞直接接觸并釋放一系列的細(xì)胞因子(TNF-α、淋巴毒素 α、IL-1、INF-γ 等)來誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的激活。Von Albertini等[11]發(fā)現(xiàn)激活的NK細(xì)胞還可以通過NF-κB途徑誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)E選擇素和IL-8來激活內(nèi)皮細(xì)胞。②NK細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的直接殺傷：NK細(xì)胞通過釋放穿孔素和顆粒酶直接殺傷移植物血管內(nèi)皮細(xì)胞，且這種殺傷作用不能被抗細(xì)胞凋亡基因BCL2及Fas與FasL途徑所抑制。此外，人NK細(xì)胞還能直接識(shí)別豬內(nèi)皮細(xì)胞上的αGal抗原;敲出αGal抗原的豬內(nèi)皮細(xì)胞能減少補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，但并不能抑制NK細(xì)胞直接對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞毒作用[12]。NK細(xì)胞的活性還受一系列細(xì)胞因子的調(diào)控。IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、INF-γ、TNF-α等可增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的殺傷作用[13]，而前列腺素(PGE1、PGE2、PGD2)和腎上腺皮質(zhì)激素等則可一定程度抑制NK細(xì)胞活性。

2 延遲性異種移植排斥反應(yīng)的防治策略

2.1 抑制抗原-抗體反應(yīng) 豬血管內(nèi)皮細(xì)胞上的αGal抗原表位是豬到靈長(zhǎng)類異種移植中發(fā)生免疫排斥反應(yīng)最主要的原因。研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)人衰變加速因子(DAF，CD55)基因豬到狒狒的異種移植中輔以靜脈注射GAS914耗竭抗αGal抗體并結(jié)合免疫抑制可阻止DXR的發(fā)生[14]。隨著GTKO豬的誕生以及在 GTKO豬內(nèi)表達(dá) α1，2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(αFT)都能有效地克服豬到靈長(zhǎng)類異種移植中DXR[15]。Kuwaki等[16]在 GTKO 豬心臟異位移植到狒狒的模型中，給已免疫抑制的狒狒注射抗CD154單克隆抗體，結(jié)果表明狒狒體內(nèi)非抗αGal抗體水平?jīng)]有升高，移植心的存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)。然而，Tazelaar等[17]在豬到狒狒異位心臟移植的研究中證實(shí)，移植心發(fā)生DXR最早的病理變化是心肌細(xì)胞空泡化，而不是血管內(nèi)凝血或心肌細(xì)胞的凝固性壞死。這說明DXR的發(fā)生可能不依賴Gal抗體或非Gal抗原引起的免疫應(yīng)答。目前機(jī)制尚不清楚，待進(jìn)一步研究證實(shí)。

2.2 抑制內(nèi)皮細(xì)胞的激活和凝血作用

2.2.1 抑制NF-κB激活 ①表達(dá)I-κB基因：在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)I-κB可阻止NF-κB向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，從而抑制Ⅱ型內(nèi)皮細(xì)胞激活和DXR的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，用重組腺病毒將I-κBα基因轉(zhuǎn)入豬血管內(nèi)皮細(xì)胞，可抑制NF-κB與DNA的結(jié)合，從而抑制TNF-α引起的 VCAM-1、IL-1、IL-6、IL-8和組織因子的表達(dá)[18]。而 Goodman 等[19]在的研究中證實(shí)，腺病毒介導(dǎo)的I-κBα過度表達(dá)于豬血管內(nèi)皮細(xì)胞可抑制NK細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的激活，但不能抑制其介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。②表達(dá)小干擾RNA(siRNA)基因：應(yīng)用的RNA干擾技術(shù)構(gòu)建針對(duì)NF-κB p65的siRNA，可降低NF-κB基因在轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)，從而抑制Ⅱ型內(nèi)皮細(xì)胞的激活。Ye等[20]研究證實(shí)通過頸靜脈將siRNA注射入小鼠體內(nèi)成功抑制了NF-κB p65在心臟的表達(dá)，阻止了內(nèi)皮細(xì)胞激活。③高表達(dá)A20等抗凋亡基因：A20是一種由TNF和IL-1等誘導(dǎo)對(duì)NF-κB基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的蛋白，可抑制TNF和IL-1的各種生物學(xué)功能。研究表明，將A20和E選擇素、IL-8、TF、I-κBα 基因共表達(dá)牛內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn) A20可抑制TNF、LPS、佛波脂(PMA)和過氧化氫對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的激活[21]。Oropeza 等[22]在轉(zhuǎn) A20 基因豬異種心臟移植的研究中發(fā)現(xiàn)表達(dá)人A20的轉(zhuǎn)基因豬血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅能抑制TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，還能減輕移植心的缺血和再灌注損傷。此外，Bcl-2、Bcl-XL、A1等基因的過度表達(dá)也能通過抑制NF-κB防止內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡。

2.2.2 表達(dá)血紅素加氧酶-1(HO-1)基因 HO-1基因是另一個(gè)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)功能的基因，目前認(rèn)為HO-1基因的表達(dá)可以起到抗氧化和抗炎的作用。Song等[23]在豚鼠到大鼠的肝臟移植中證實(shí)，HO-1基因的表達(dá)抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的激活，延緩了DXR的發(fā)生。

2.2.3 轉(zhuǎn)人補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白基因和免疫抑制劑抗補(bǔ)體激活 培育轉(zhuǎn)基因豬使其表達(dá)一種或多種人CRP，如 DAF、膜輔助蛋白(MCP，CD46)、同源限制因子(HRF)和膜反應(yīng)性溶解抑制物(MIRL，CD59)等，用人血清處理這種表達(dá)人CRP的豬血管內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞表面補(bǔ)體沉積減少，補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用受到抑制。研究表明，表達(dá)人DAF的豬血管內(nèi)皮細(xì)胞可減少補(bǔ)體的沉積，抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞激活[24]。此外，陳棟等[25]在豬到獼猴的異位心臟移植中發(fā)現(xiàn)應(yīng)用中華眼鏡蛇毒因子(Y-CVF)可完全清除獼猴體內(nèi)補(bǔ)體，延長(zhǎng)移植心的存活時(shí)間，但移植心臟排斥后仍有一定的補(bǔ)體沉積，目前機(jī)制尚不清楚，待進(jìn)一步研究證實(shí)。

2.2.4 抑制凝血作用 控制凝血調(diào)節(jié)因子可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的激活和血栓形成。研究表明用人血灌注表達(dá)人CD39的轉(zhuǎn)基因小鼠的胰島，其凝血時(shí)間較對(duì)照組非轉(zhuǎn)基因小鼠的胰島顯著延長(zhǎng)，且對(duì)胰島的功能無(wú)影響[26]。Chen 等[27]在表達(dá)組織因子途徑抑制物(TFPI)或水蛭素的轉(zhuǎn)基因小鼠心臟移植給大鼠的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟存活時(shí)間超過100天，較對(duì)照組非轉(zhuǎn)基因小鼠心臟移植明顯延長(zhǎng)。此外給予系統(tǒng)的藥物治療(如靜脈輸入抗凝血酶Ⅲ因子或選擇性抑制豬vWF因子與人GP1b蛋白的結(jié)合)也是抑制凝血的途徑[28，29]。目前研究者們正在建立以GTKO豬為基本模型，表達(dá)人TFPI、水蛭素、血栓調(diào)節(jié)蛋白和CD39一種或幾種基因的動(dòng)物模型來克服DXR中的凝血。

2.3 抑制NK細(xì)胞的活性

2.3.1 表達(dá)經(jīng)典和非經(jīng)典HLAⅠ類基因 人NK細(xì)胞通過NKR識(shí)別經(jīng)典和非經(jīng)典的HLAⅠ類分子，并通過負(fù)反饋抑制自身的活性。Seebach等[30]在豬內(nèi)皮細(xì)胞上轉(zhuǎn)染HLA-A2、HLA-B27和HLA-Cw3三種經(jīng)典的HLAⅠ類分子，發(fā)現(xiàn)只有HLA-Cw3可以部分抑制NK細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的殺傷作用。Forte等[31]發(fā)現(xiàn)表達(dá)HLA-Cw4的豬血管內(nèi)皮細(xì)胞能減少NK細(xì)胞的黏附和細(xì)胞毒作用，但同時(shí)表達(dá)HLACw4和HLA-Cw3的豬血管內(nèi)皮細(xì)胞并不能完全克服NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。此外，非經(jīng)典HLAⅠ類分子不具有或很少具有多態(tài)性，可比經(jīng)典的HLAⅠ類分子更有效地抑制NK細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)可溶的HLA-G1和HLA-E均能有效地抑制NK細(xì)胞對(duì)豬內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞毒作用[32，33]。

2.3.2 表達(dá)NK細(xì)胞受體的配體 ①表達(dá)NK細(xì)胞抑制受體的配體：體外實(shí)驗(yàn)證明，在豬血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)人巨細(xì)胞病毒蛋白UL18可抑制人體NK細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的直接殺傷作用，并抑制NK細(xì)胞釋放IFN-γ[34]。②表達(dá)抑制NK細(xì)胞激活受體的配體：在豬血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)人巨細(xì)胞病毒蛋白UL141可抑制CD155與NK細(xì)胞激活受體CD226(DNAM-1)和CD96(TACTILE)結(jié)合，從而抑制了NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞裂解[35]。此外，Lilienfeld 等[10]用 RNA 干擾pULBP1基因可部分抑制NK細(xì)胞激活受體NKG2D，用抗pULBP1多克隆抗體可完全將其抑制，從而阻遏了NK細(xì)胞的介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。

3 展望

在利用基因工程技術(shù)初步克服了HAR的今天，DXR是異種移植排斥反應(yīng)中的主要障礙。隨著對(duì)其認(rèn)識(shí)的不斷深入，目前在應(yīng)對(duì)策略上已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但并不能完全解決問題?？紤]到其是多種因素共同作用下的一個(gè)復(fù)雜的免疫病理過程，采用以GTKO豬為基本模型并聯(lián)合其他策略將是進(jìn)一步研究的趨勢(shì)。

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